Diagnostyka biochemiczna chorób wątroby. Krótka informacja o strukturze wątroby.

Wątroba jest niesparowanym narządem o masie 1300-1800 g. Ponad 60% komórek wątroby to komórki miąższowe - hepatocyty, 25% to komórki układu retikulohistiocytowego (CSG), komórki śródbłonka lub komórki Kupffera, reszta to przewód, tkanka łączna i inne komórki.

Strukturalną i funkcjonalną jednostką wątroby jest trądzik wątrobowy lub zrazik wątrobowy, który powstaje głównie z hepatocytów (ryc. 1). Pośrodku zrazika wątrobowego znajduje się żyła wątrobowa, z której promieniowanie wątroby składa się głównie z pojedynczego rzędu hepatocytów. Żyła wątrobowa znajduje się w środku płatka, a na obwodzie znajduje się pole portalowe z gałęziami tętnicy wątrobowej, żyły wrotnej i najmniejszej kapilary żółciowej. Pomiędzy belkami znajdują się rozszerzone naczynia włosowate - zatoki wątroby. Hepatocyty, które tworzą wiązki, z jednej strony, zwane biegunem naczyniowym, zwrócone są w stronę zatok, a inwazje błony sąsiedniej strony, zwane biegunem żółciowym, tworzą pierwotne naczynia włosowate żółci (ryc. 2). Charakterystyczną cechą kanalików żółciowych jest ich całkowita izolacja od naczyń włosowatych. Przez błonę endocytozy naczyniowej i egzocytozy różnych cząsteczek i żółci - uwalnianie substancji z komórki. Żyła wrotna i tętnica wątrobowa wchodzą do wątroby, a żyła wątrobowa i przewód żółciowy wychodzą.

Acini jest podzielony na 3 strefy funkcjonalne: w 1 strefie znajdują się komórki sąsiadujące z kanałem wrotnym, są one lepiej zaopatrzone w tlen i składniki odżywcze. Komórki trzeciej strefy, zlokalizowane wokół żyły wątrobowej, są mniej zaopatrzone w tlen i substraty oraz bardziej wrażliwe na niedokrwienie. To komórki tej strefy biorą udział w metabolizmie leków i są celem leków hepatotoksycznych.

Podczas prowadzenia badań laboratoryjnych w celu prawidłowej diagnozy ważne jest poznanie rozkładu enzymów wewnątrz komórki. Poniżej przedstawiono dane dotyczące enzymów najczęściej stosowanych do diagnozy.

Cytoplazma zawiera aminotransferazę alaninową (ALT), część aminotransferazy asparaginianowej (AST), dehydrogenazę mleczanową (LDH), część gammaglutamylotranspeptydazy (GGT) i inne enzymy.

W mitochondriach (MX) większość AST (około 70%), dehydrogenaza glutaminianowa (GLDG), dehydrogenaza alkoholowa i wiele innych są skoncentrowane.

Szorstka retikulum endoplazmatyczne zawiera cholinesterazę (CE) itp.

W gładkiej retikulum endoplazmatycznym są glukozo-6-fosfataza, UDP-glukuronylotransferaza, związany z hemem cytochrom P-450 związany z błoną i inne.

Lizosomy zawierają kwaśne hydrolazy (kwaśna fosfataza, rybonukleaza itp.), które są aktywowane przez obniżenie pH komórki.

Mikrokosmki słupa żółciowego zawierają enzymy zależne od błon, takie jak fosfataza alkaliczna (fosfataza alkaliczna), 5-nukleotydaza, część GGT, aminopeptydaza leucynowa (LAP).

Znajomość architektury architektonicznej wątroby i rozmieszczenie enzymów w komórce wyjaśnia nierówny wzrost aktywności enzymów w różnych procesach patologicznych. Tak więc, z dominującą zmianą centralnych części zrazików (ostre alkoholowe zapalenie wątroby, ostra zastój żylny itp.), Zwiększa się aktywność mitochondrialnej dehydrogenazy glutaminianowej - brak tlenu i uszkodzenia MX, a wraz z porażką dróg portalowych (ostre wirusowe zapalenie wątroby, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby - CAG), wzrasta aktywność transaminazy cytoplazmatycznej.

Diagnostyka biochemiczna chorób

Informacje kontaktowe
Towary i usługi
Napraw

Biochemia kliniczna, wraz z fizjologią patologiczną i normalną, jest jednym z trzech wielorybów podstawowych nauk medycznych. Bez znajomości podstaw tej dyscypliny lekarz nie różni się od ucznia, który ma pojęcie o chorobach tylko na podstawie objawów i oznak.

Tymczasem wskaźniki kliniczne i biochemiczne, które monitorują zmiany w komórkach na poziomie cząsteczek i reakcje chemiczne, pozwalają wiarygodnie określić przyczyny stanów patologicznych całego ciała. Zależy to od poziomu szkolenia lekarza, jak kompetentnie podejmie się wyboru niezbędnych analiz biochemicznych do kompleksowego badania pacjenta, a także będzie mógł ocenić ich informacje diagnostyczne, wartość i wiarygodność.

W medycynie laboratoryjne badania biochemiczne są szeroko stosowane do:

- dokładna diagnoza,

- wykrycie choroby na etapie przedklinicznym,

- ocenić skuteczność przepisanego leczenia,

- monitorowanie stanu pacjenta

- przewidywanie możliwych powikłań i wyników choroby.

Zalecane testy biochemiczne

Opracowano znormalizowane metody badawcze dla głównych systemów ciała, które muszą być przeprowadzane niezawodnie z odpowiednim kompleksem objawów:

Patologia układu sercowo-naczyniowego.

Dusznica bolesna (koagulogram, cholesterol z frakcjami, aminotransferazy, triglicerydy, frakcje lipoprotein, wskaźnik aterogenny, dehydrogenaza mleczanowa z izoenzymami, kinaza kreatynowa z izoenzymami);

Nadciśnienie (cholesterol z frakcjami, cholinesteraza, mocznik, kwas moczowy, kreatynina, trójglicerydy, wskaźnik miażdżycowy, poziom elektrolitów K i Na);

Miażdżyca tętnic (cholesterol z frakcjami, frakcje lipoproteinowe, triglicerydy, wskaźnik aterogenny);

Zawał mięśnia sercowego (białka stresowe, kinaza kreatynowa z izoenzymami, aminotransferazy, mocznik, cholinesteraza, koagulogram, kwas moczowy, dehydrogenaza mleczanowa z izoenzymami);

Niedociśnienie (17ОКС, zawartość hydrokortyzonu w moczu).

Patologia układu tkanki łącznej.

Reumatyzm (białko całkowite z frakcjami białkowymi, glikoproteinami, testy sedymentacyjne, białka stresowe, heksozy glikoprotein, fibrynogen, kwasy sialowe);

Reumatoidalne zapalenie stawów (białko wspólne z frakcjami białkowymi, glikoproteinami, kwasami sialowymi);

Dna moczanowa (białko całkowite z frakcjami białkowymi, kreatyniną, kwasem moczowym, białkami stresowymi, glikoproteinami);

Twardzina (całkowite białko z frakcjami białkowymi, fibrynogenem, białkami stresowymi, hydroksyproliną).

Patologia układu żółciowego i żołądkowo-jelitowego.

Choroba kamicy żółciowej (bilirubina z frakcjami, fosfataza alkaliczna, transpeptydaza Y-glutamylowa);

Zanikowe zapalenie żołądka (pepsynogen, gastryna);

Przewlekłe zapalenie trzustki (glukoza, tolerancja glukozy, białko całkowite z frakcjami białkowymi, amylaza z izoenzymami, lipaza w moczu i we krwi);

Martwica trzustki (amylaza);

Dystroficzno-degeneracyjne zmiany w wątrobie, postać tłuszczowa (mocznik, dehydrogenaza glutaminianowa, aminotransferaza alaninowa, cholinesteraza, aminotransferaza asparaginianowa);

Marskość wątroby (mocznik, cholesterol, aminotransferaza asparaginianowa, kreatynina, aminotransferaza alaninowa, frakcje białkowe, lipoproteiny β, próbki osadowe);

Przewlekłe zapalenie wątroby (takie same badania, jak marskość wątroby, plus dehydrogenaza mleczanowa z izoenzymami, białko całkowite, fosfataza alkaliczna);

Zapalenie wątroby jest ostre (te same badania, co w postaci przewlekłej, z wyjątkiem fosfatazy alkalicznej i mocznika).

Patologia układu oddechowego.

Ropień płuc, ostre zapalenie oskrzeli, astma oskrzelowa (białko całkowite z frakcjami, białko stresowe);

Rozstrzenie oskrzeli (takie same, plus fibrynogen);

Przewlekłe zapalenie płuc (białko całkowite z frakcjami, białko stresowe, dehydrogenaza mleczanowa z izoenzymami);

Ostre zapalenie płuc (takie same jak przewlekłe, plus glikoproteiny, próbki osadowe, kwasy sialowe)

Gruźlica (całkowite białko z frakcjami, białkiem stresowym, kwasami sialowymi, glikoproteiną, próbkami osadu).

Patologia układu moczowego.

Niewydolność nerek, ostra i przewlekła (całkowite białko z frakcjami, kreatynina, białko moczu, mocznik, zawartość elektrolitów Na, Cl, K, Ca);

Choroba nerek (taka sama jak w przypadku niedoboru, plus kwas moczowy i elektrolit P, z wyjątkiem Cl);

Zespół nerczycowy (taki sam jak w niewydolności plus elektrolit Mg z wyjątkiem Cl);

Amyloidoza nerek (taka sama jak w niedoborze, plus elektrolit Mg z wyjątkiem Cl i Y - glutamyl transpeptydazy);

Przewlekłe odmiedniczkowe zapalenie nerek (wspólne białko z frakcjami, białka stresowe, fosfataza alkaliczna, cholinesteraza, białko moczu, transpeptydaza Y-glutamylowa);

Kłębuszkowe zapalenie nerek (białko całkowite z frakcjami, białka stresowe, mocznik, transpeptydaza Y-glutamylowa, kreatynina, dehydrogenaza mleczanowa z izoenzymami, cholinesteraza).

Patologia układu hormonalnego.

Cukrzyca (glukoza w moczu i we krwi, insulina, aceton, cholesterol, beta-lipoproteiny, z prawdopodobieństwem ukrytej postaci - test na wrażliwość na glukozę);

Cukrzyca niecukrowa (glukoza, wazopresyna, test tolerancji glukozy);

Niedoczynność przytarczyc (fosfataza alkaliczna, zawartość elektrolitów K i P we krwi i moczu);

Niedoczynność tarczycy (tyroksyna, trójjodotyronina, trójglicerydy, beta-lipoproteiny, cholesterol, mocznik);

Ropne zapalenie tarczycy (tyroksyna, trójjodotyronina, białka stresowe, białko całkowite z frakcjami);

Autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (tyroksyna, trijodotyronina, absorpcja jodu131 przez tarczycę, jod związany z białkami);

Wole jest endemiczne (takie samo jak w postaci autoimmunologicznej zapalenia tarczycy, plus cholesterol i mocznik w moczu);

Wole rozlane, toksyczne (tyroksyna, trijodotyronina, TSH, jodyny związane z białkami, glukoza, mocznik, cholesterol).

Jeśli lekarz uzna to za konieczne, oprócz głównych dodatkowych badań laboratoryjnych są wyznaczane. (Obejrzyj leczenie)

Dekodowanie analizy biochemicznej krwi

Co pokazuje biochemiczne badanie krwi?

Krew jest jednym z biomateriałów organizmu. Jest obecny we wszystkich narządach i tkankach. Jego skład obejmuje substancje, które powstają podczas pracy wszystkich narządów. Badanie krwi do biochemii określa obecność i poziom jego składników.

Porównując dane diagnostyczne i wartości normalne, można określić stan funkcjonalny narządów, aby określić charakter występujących w nich patologii. W niektórych chorobach biochemia krwi jest jedynym sposobem obiektywnego potwierdzenia diagnozy.

Poza głównymi (glukoza, hemoglobina, kreatynina, cholesterol i inne) analiza biochemiczna ujawnia także specyficzne wskaźniki (elektrolity, surowica, czynnik reumatoidalny i inne) niezbędne do diagnozy chorób endokrynologicznych i genetycznych. Metoda ma również zastosowanie w pediatrii, medycynie sportowej do oceny stanu funkcjonalnego organizmu dzieci, sportowców.

Jakie są wskazania do analizy biochemicznej krwi?

Często biochemia jest zalecana pacjentom hospitalizowanym lub ambulatoryjnym. Wykonuje się badanie krwi w celu zdiagnozowania lub monitorowania skuteczności leczenia. Lekarz indywidualnie określa listę wskaźników, których poziom należy ustalić u pacjenta. Może to być jeden wskaźnik (na przykład glukoza w cukrzycy) lub kilka (na przykład testy czynności wątroby - białko całkowite, bilirubina, wskaźnik protrombiny, ALT, AST - w zapaleniu wątroby).

Wskazania do badania to choroby:

  • układ wątrobowo-żółciowy;
  • nerki;
  • układ hormonalny;
  • serca;
  • układ mięśniowo-szkieletowy;
  • układ krążenia;
  • przewód pokarmowy.

W połączeniu z metodami diagnostyki instrumentalnej biochemia krwi pomaga w prawidłowej diagnozie patologii narządów wewnętrznych.

Jak wykonać badanie krwi na biochemię?

Analiza biochemiczna bada krew żylną. Weź biomateriał z żył obwodowych (łokciowych lub promieniowych). Przy ograniczonym dostępie do przedramienia (złamania, oparzenia itp.) Krew pobierana jest z dowolnej innej żyły (na ręce, stopy, nogi).

Przed przejściem analizy pacjent powinien przygotować:

  • 8 godzin przed oddaniem krwi nie można jeść, pić napojów zawierających cukier;
  • przez 2 dni musisz powstrzymać się od alkoholu i tłustych potraw;
  • w przededniu badania unikaj stresu fizycznego i emocjonalnego.

Analizę podaje się przed leczeniem, przed procedurami diagnostycznymi i terapeutycznymi (badanie rentgenowskie, fizjoterapia itp.).

Miejsce nakłucia skóry jest traktowane środkiem antyseptycznym - 96% alkoholem etylowym lub roztworem nadtlenku wodoru. Krew w objętości 5-10 ml zbiera się w sterylnej suchej probówce, którą przesyła się do badania.

Normy analizy biochemicznej krwi (tabela)

Norma u dorosłych

U dzieci poniżej 14 lat

Bilirubina całkowita (tbil)

do 250 µmol / l (noworodki)

Bilirubina bezpośrednia (idbil)

Fosfataza alkaliczna (alp)

Lipoproteins VP (hdl)

Do 6 g / l (podczas ciąży)

Kwas moczowy (kwas moczowy)

C-reaktywne białko (crp)

Antistreptolysin O (także aslo)

Jak rozszyfrować analizę biochemiczną?

Rozszyfrowanie analizy biochemicznej krwi jest porównaniem wyników uzyskanych z normami wskaźników. Formularz analizy zawiera pełną listę substancji określonych przez laboratorium biochemiczne i ich wartości referencyjne. Czasami wystarczy ustalić ostateczną diagnozę na podstawie odchylenia od normy jednego lub kilku parametrów. Ale częściej, aby to potwierdzić, potrzebujesz wyników dodatkowych badań. Następnie rozważymy, co oznacza odchylenie od norm głównych wskaźników biochemii krwi, dla których choroby jest typowe.

Całkowite białko

Białko całkowite to zbiór białek w osoczu krwi. Jego poziom pomaga zidentyfikować choroby narządów wewnętrznych i krwi. Wskaźnik wzrasta w warunkach:

  • odwodnienie organizmu (wymioty, biegunka, oparzenia itp.);
  • ostre i przewlekłe zakażenia;
  • choroby onkologiczne.

Poziom białka całkowitego spada z:

  • niedobór białka podczas postu;
  • choroba wątroby;
  • ostre i przewlekłe krwawienie;
  • tyreotoksykoza.

Bilirubina

Bilirubina jest pigmentem żółciowym, który powstaje w wyniku niszczenia czerwonych krwinek. Metabolizm występuje z powodu normalnego funkcjonowania wątroby. Jego poziom zależy od chorób wątroby, dróg żółciowych, niedokrwistości. Bilirubina jest wolną i związaną frakcją. Wzrost pierwszego wskaźnika występuje, gdy:

  • ostre wirusowe, toksyczne, lekowe zapalenie wątroby;
  • bakteryjne uszkodzenie wątroby (leptospiroza, bruceloza itp.);
  • nowotwory wątroby, pierwotna marskość żółciowa;
  • niedokrwistość hemolityczna.

Zwiększona zawartość związanej bilirubiny jest typowa dla chorób, które zakłócają przepływ żółci:

  • choroba kamicy żółciowej;
  • guz trzustki;
  • choroby zapalne dróg żółciowych itp.

Enzymy

Aktywność enzymatyczna charakteryzuje stan narządów wewnętrznych. Zwiększona wydajność dzięki pokonaniu komórek organicznych. Wzrost poziomu aminotransferazy ALAT, ALAT występuje, gdy:

  • ostre, przewlekłe zapalenie wątroby;
  • martwica wątroby;
  • zawał mięśnia sercowego;
  • urazy i choroby mięśni szkieletowych;
  • cholestaza;
  • ciężkie niedotlenienie tkanek.

Podwyższone poziomy dehydrogenazy mleczanowej (LDH) są typowe dla:

  • zawał mięśnia sercowego, nerka;
  • zapalenie mięśnia sercowego;
  • rozległa hemoliza;
  • zator płucny;
  • ostre zapalenie wątroby.

Wysoki poziom fosfokinazy kreatynowej (CPK) może wystąpić, gdy:

  • zawał mięśnia sercowego;
  • martwica mięśni szkieletowych;
  • padaczka;
  • zapalenie mięśni i dystrofia mięśniowa.

Mocznik należy do grupy substratów - związku o niskiej masie cząsteczkowej, który jest syntetyzowany przez wątrobę. Poziom substancji we krwi zależy od zdolności filtracyjnej nerek i syntetycznej funkcji wątroby. Przyczyny wzrostu:

  • choroby nerek (zapalenie kłębuszków nerkowych, amyloidoza, odmiedniczkowe zapalenie nerek, leczenie lekami nefrotoksycznymi);
  • niewydolność sercowo-naczyniowa;
  • ogromna utrata krwi;
  • oparzenia;
  • naruszenie odpływu moczu;
  • jedzenie nadmiaru białka.

Przyczyny obniżenia poziomu mocznika:

  • post i surowy wegetarianizm;
  • zatrucie truciznami;
  • ciąża;
  • naruszenie syntetycznej funkcji wątroby.

Kwas moczowy

Kwas moczowy jest końcowym produktem metabolizmu niektórych białek. Jego główna część jest wydalana przez nerki, reszta - z kałem. Wzrost poziomu kwasu moczowego we krwi wskazuje na następujące warunki:

  • niewydolność nerek;
  • białaczka;
  • chłoniak;
  • przedłużony post;
  • nadużywanie alkoholu;
  • przedawkowanie salicylanów i diuretyków.

Ile kosztuje biochemiczne badanie krwi?

Koszt biochemicznych badań krwi zależy od liczby określonych parametrów. Cena każdego z nich waha się od 130-300 rubli. Najdroższą metodą biochemicznych badań krwi jest immunoelektroforeza, której koszt w niektórych klinikach sięga 1000 rubli.

Biochemia i patobiochemia wątroby. Biochemiczna diagnoza choroby wątroby

Diagnostyka biochemiczna chorób wątroby.

BIOCHEMICZNA DIAGNOSTYKA CHORÓB WĄTROBY.

Krótka informacja o strukturze wątroby.

Wątroba jest niesparowanym narządem o masie 1300-1800 g. Ponad 60% komórek wątroby to komórki miąższowe - hepatocyty, 25% to komórki układu retikulohistiocytowego (CSG), komórki śródbłonka lub komórki Kupffera, reszta to przewód, tkanka łączna i inne komórki.

Strukturalną i funkcjonalną jednostką wątroby jest trądzik wątrobowy lub zrazik wątrobowy, który powstaje głównie z hepatocytów (ryc. 1). Pośrodku zrazika wątrobowego znajduje się żyła wątrobowa, z której promieniowanie wątroby składa się głównie z pojedynczego rzędu hepatocytów. Żyła wątrobowa znajduje się w środku płatka, a na obwodzie znajduje się pole portalowe z gałęziami tętnicy wątrobowej, żyły wrotnej i najmniejszej kapilary żółciowej. Pomiędzy belkami znajdują się rozszerzone naczynia włosowate - zatoki wątroby. Hepatocyty, które tworzą wiązki, z jednej strony, zwane biegunem naczyniowym, zwrócone są w stronę zatok, a inwazje błony sąsiedniej strony, zwane biegunem żółciowym, tworzą pierwotne naczynia włosowate żółci (ryc. 2). Charakterystyczną cechą kanalików żółciowych jest ich całkowita izolacja od naczyń włosowatych. Przez błonę endocytozy naczyniowej i egzocytozy różnych cząsteczek i żółci - uwalnianie substancji z komórki. Żyła wrotna i tętnica wątrobowa wchodzą do wątroby, a żyła wątrobowa i przewód żółciowy wychodzą.

Acini jest podzielony na 3 strefy funkcjonalne: w 1 strefie znajdują się komórki sąsiadujące z kanałem wrotnym, są one lepiej zaopatrzone w tlen i składniki odżywcze. Komórki trzeciej strefy, zlokalizowane wokół żyły wątrobowej, są mniej zaopatrzone w tlen i substraty oraz bardziej wrażliwe na niedokrwienie. To komórki tej strefy biorą udział w metabolizmie leków i są celem leków hepatotoksycznych.

Podczas prowadzenia badań laboratoryjnych w celu prawidłowej diagnozy ważne jest poznanie rozkładu enzymów wewnątrz komórki. Poniżej przedstawiono dane dotyczące enzymów najczęściej stosowanych do diagnozy.

Cytoplazma zawiera aminotransferazę alaninową (ALT), część aminotransferazy asparaginianowej (AST), dehydrogenazę mleczanową (LDH), część gammaglutamylotranspeptydazy (GGT) i inne enzymy.

W mitochondriach (MX) większość AST (około 70%), dehydrogenaza glutaminianowa (GLDG), dehydrogenaza alkoholowa i wiele innych są skoncentrowane.

Szorstka retikulum endoplazmatyczne zawiera cholinesterazę (CE) itp.

W gładkiej retikulum endoplazmatycznym są glukozo-6-fosfataza, UDP-glukuronylotransferaza, związany z hemem cytochrom P-450 związany z błoną i inne.

Lizosomy zawierają kwaśne hydrolazy (kwaśna fosfataza, rybonukleaza itp.), które są aktywowane przez obniżenie pH komórki.

Mikrokosmki słupa żółciowego zawierają enzymy zależne od błon, takie jak fosfataza alkaliczna (fosfataza alkaliczna), 5-nukleotydaza, część GGT, aminopeptydaza leucynowa (LAP).

Znajomość architektury architektonicznej wątroby i rozmieszczenie enzymów w komórce wyjaśnia nierówny wzrost aktywności enzymów w różnych procesach patologicznych. Tak więc, z dominującą zmianą centralnych części zrazików (ostre alkoholowe zapalenie wątroby, ostra zastój żylny itp.), Zwiększa się aktywność mitochondrialnej dehydrogenazy glutaminianowej - brak tlenu i uszkodzenia MX, a wraz z porażką dróg portalowych (ostre wirusowe zapalenie wątroby, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby - CAG), wzrasta aktywność transaminazy cytoplazmatycznej.
Główne funkcje wątroby.

Wątroba nazywana jest centralnym laboratorium metabolicznym, ponieważ równie skutecznie przekształca substancje pochodzące z jelit i produktów metabolicznych powstających w różnych narządach i tkankach w wyniku ich żywotnej aktywności. Obecnie znanych jest ponad 500 funkcji metabolicznych. Krótko rozważ główne.

1. Syntetyczny. Wątroba syntetyzuje białka, enzymy, czynniki krzepnięcia, cholesterol, fosfolipidy itp. Główne tworzenie ciał ketonowych zachodzi w wątrobie.

2. Detoksykacja dla endogenny (amoniak, bilirubina itp.). i egzogenny (narkotyki itp.) substancje. Detoksykacja leków obejmuje 2 fazy: 1 - modyfikacja leków w reakcjach redoks przy użyciu cytochromu P 450 i sprzęganie leków z substancjami rozpuszczalnymi w wodzie przez dodanie glukuronowego, kwasu siarkowego, glutationu itp. W przypadku chorób wątroby reakcje pierwszej fazy są zmniejszone lub nieobecne.

3. Sekrecja - wydzielanie żółci. Aparat do wydzielania żółci obejmuje kanaliki żółciowe, mikrokosmki, sąsiadujące z nimi lizosomy i kompleks Golgiego. Mechanizm wydzielania żółci obejmuje uwalnianie cholesterolu, kwasów żółciowych, pigmentów, fosfolipidów w postaci specyficznego kompleksu makrocząsteczkowego - miceli żółciowej. Pierwotne kwasy żółciowe powstające w wątrobie wchodzą do jelita, gdzie w wyniku flory jelitowej przekształcają się w wtórne kwasy żółciowe. Te ostatnie są wchłaniane w jelicie i wracają do wątroby (krążenie jelitowo-wątrobowe). Wątroba łączy je z glicyną i tauryną, zamieniając je w związki amfifilowe o wysokiej zdolności do emulgowania hydrofobowych. substancje. Wszelkie procesy powodujące naruszenie proporcji składników żółci (hormonalnych, zapalnych itp.) Prowadzą do naruszenia wydzielania żółci - cholestazy.

4. Wydalanie - wydalanie z żółcią różnych substancji, w tym ciał stałych.

Wątroba bierze udział we wszystkich rodzajach metabolizmu.

1. Wymiana białek. Wątroba syntetyzuje następujące białka:

albumina 100%, fibrynogen

1-globuliny 90%, czynniki krzepnięcia krwi

2-globuliny 75% (w tym zależne od witaminy K)

Glob-globuliny 50%, pseudocholinesteraza (CE)

Albumina należy do najlżejszych białek krwi, OMM 65-70 kD, i jest syntetyzowana wyłącznie przez wątrobę. Albuminy utrzymują ciśnienie onkotyczne, spadek ich zawartości prowadzi do obrzęku. Jeśli zmniejszenie stężenia albuminy nie jest związane z niedożywieniem, naruszeniem wchłaniania jelitowego lub dużą utratą białka, wynika to z wyraźnego spadku czynności wątroby. Albuminy odgrywają ważną rolę w transporcie substancji słabo rozpuszczalnych w wodzie (hydrofobowych). Takie substancje obejmują bilirubinę, cholesterol, kwasy tłuszczowe, wiele hormonów i leków. Naruszenie funkcji transportowej albuminy prowadzi do wielu zmian patologicznych.

Wątroba utrzymuje poziom aminokwasów, w tym. cykliczny (tyrozyna, tryptofan, fenyloalanina), neutralizuje amoniak, zamieniając go w mocznik. Synteza mocznika jest jedną z najbardziej stabilnych funkcji wątroby.

2. Wymiana lipidów. Synteza cholesterolu jest w 90% przeprowadzana przez wątrobę i jelita. Znaczna część cholesterolu w wątrobie jest przekształcana w kwasy żółciowe, hormony steroidowe, witaminę D2. Wątroba przekształca krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, które są toksyczne dla mózgu (4-8 atomów węgla - kwas kapronowy, izowalerianowy itp.) W długołańcuchowe kwasy tłuszczowe (16-18 atomów węgla).

3. Wymiana węglowodanów. Wątroba utrzymuje stabilny poziom glikemii przez glikogenezę, glikogenolizę, glukoneogenezę. Wątroba wytwarza insuliny - enzymy rozkładające insulinę, wspomagające poziom kwasu mlekowego i pirogronowego.

4. Metabolizm pigmentu obejmuje konwersję w hepatocycie przez sprzęganie z kwasem glukuronowym toksycznej, rozpuszczalnej w tłuszczach bilirubiny pośredniej do nietoksycznego, rozpuszczalnego w wodzie bezpośredniego. Uwalnianie glukuronidu bilirubującego może nastąpić albo przez bezpośrednie wydzielanie do kapilary żółciowej, albo przez włączenie do miceli żółci.

5. Metabolizm porfiryny obejmuje syntezę hemu składającego się z kompleksu protoporfiryny z żelazem. Hem jest niezbędny do syntezy enzymów wątrobowych zawierających hem (cytochromy itp.). Wrodzona nieprawidłowość syntezy hemu w wątrobie prowadzi do chorób - porfirii wątrobowej.

6. Wymiana hormonów. W chorobach wątroby obserwuje się wzrost poziomu hormonów, związany z naruszeniem ich wydzielania z żółcią lub zakłóceniem normalnego metabolizmu hormonalnego (niedostateczne zniszczenie). Zwiększa się poziom adrenaliny i noradrenaliny (mediatory współczulnego układu nerwowego), aldosteronu mineralokortykoidów, hormonów płciowych, zwłaszcza estrogenów, hormonów tkankowych serotoniny i histaminy.

7. Wymiana pierwiastków śladowych. Wątroba syntetyzuje białka do transportu (transferryny) i odkładania (ferrytyny) żelaza, jest także głównym depotem żelaza. Wątroba odgrywa ważną rolę w metabolizmie miedzi: syntetyzuje ceruloplazminę, glikoproteinę, która wiąże do 90% miedzi z krwi, a także absorbuje miedź luźno związaną z albuminą z osocza krwi i wydziela nadmiar miedzi przez lizosomy z żółcią do jelita. Wątroba bierze udział w wymianie innych pierwiastków śladowych i elektrolitów.

Główne zespoły w chorobach wątroby.
W różnych chorobach wątroby niektóre rodzaje metabolizmu lub pewne funkcje narządu są zaburzone. Niektórym chorobom towarzyszy przeważające uszkodzenie komórek wątroby. inne - pierwotne naruszenie odpływu żółci, itp., więc diagnoza chorób wątroby jest często przeprowadzana syndromowo. Poniżej opisano główne zespoły (Tabela 7).

1. Zespół cytolityczny (cytoliza) występuje w wyniku zakłócenia struktury komórek wątroby, zwiększenia przepuszczalności błony, z reguły z powodu zwiększonych procesów peroksydacji lipidów (LPO) i uwalniania enzymów do krwi. W zespole cytolitycznym zarówno cytoplazmatyczne, jak i mitochondrialne składniki enzymów dostają się do krwiobiegu, ale izoenzymy cytoplazmatyczne określają główny poziom aktywności. Cytoliza towarzyszy głównie ostrym chorobom wątroby i nasila się wraz z zaostrzeniem chorób przewlekłych. Rozróżnia się następujące główne mechanizmy cytolizy:

1) toksyczna cytoliza (wirusowa, alkoholowa, lekowa);

2) cytoliza immunologiczna, w tym autoimmunologiczny;

4) niedotlenienie („wstrząsowa wątroba” itp.);

5) cytoliza nowotworu;

6) cytoliza związana z niedoborami żywieniowymi i nieadekwatnością pokarmu.

Cytoliza nie jest identyczna z martwicą komórek: podczas cytolizy komórka pozostaje żywa i zdolna do różnych rodzajów metabolizmu, w tym syntezy enzymów, dlatego podczas cytolizy aktywność enzymów może zwiększyć dziesiątki lub setki razy i pozostać podwyższona przez długi czas. Martwica oznacza śmierć komórki, więc wzrost aktywności enzymów może być znaczący, ale krótkotrwały.

Głównymi dostępnymi markerami cytolizy w ostrym zapaleniu wątroby są alanina (ALT) i asparaginianowa (AST) transaminaza, gamma-glutamyl transpeptydaza (GGT), dehydrogenaza mleczanowa (LDH).

Zwiększona ALT i AST obserwowane u 88-97% pacjentów w zależności od rodzaju zapalenia wątroby, ponad połowa z nich, jest znaczny (10-100 razy) wzrost. Maksymalna aktywność jest charakterystyczna dla 2-3 tygodnia choroby, a powrót do normy następuje w 5-6 tygodniu. Przekroczenie normalizacji aktywności jest czynnikiem niekorzystnym. Aktywność ALT> AST, która jest związana z dystrybucją AST między cytoplazmą a mitochondriami. Dominujący wzrost AST jest związany z uszkodzeniem mitochondriów i jest obserwowany przy bardziej poważnym uszkodzeniu wątroby, zwłaszcza alkoholu. Aktywność transaminazy zwiększa się umiarkowanie (2-5 razy) w przewlekłych chorobach wątroby, zwykle w ostrej fazie, i guzach wątroby. W przypadku marskości wątroby wzrost aktywności tranaminaz na ogół nie jest charakterystyczny.

Transpeptydaza gamma-glutamylowa (GGT, GGTP, -GT) jest zawarty w cytoplazmie (izoforma o niskiej masie cząsteczkowej) i jest związany z błonami bieguna żółciowego (izoforma o wysokiej masie cząsteczkowej). Wzrost jego aktywności może być związany z cytolizą, cholestazą, zatruciem alkoholem lub lekiem, wzrostem guza, dlatego wzrost aktywności GGT nie jest specyficzny dla konkretnej choroby, ale do pewnego stopnia powszechny lub przesiewowy w kierunku chorób wątroby, chociaż wymaga dodatkowych poszukiwań przyczyny choroby.

Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) wzrasta wraz z wieloma chorobami. Wartość diagnostyczna całkowitej aktywności jest niewielka i ogranicza się do definicji wykluczającej procesy nowotworowe i hemolityczne, jak również do diagnostyki różnicowej zespołu Gilberta (normalny) i przewlekłej hemolizy (zwiększonej). W diagnostyce choroby wątroby bardziej istotna ocena izoenzymu wątrobowego LDH - LDH5.

Wzrost aktywności jednego lub wszystkich enzymów wskazuje na ostrą chorobę wątroby, zaostrzenie choroby przewlekłej lub proces nowotworowy, ale nie wskazuje na charakter choroby i nie pozwala na postawienie diagnozy.
2. Zespół cholestatyczny (cholestaza) charakteryzuje się naruszeniem wydzielania żółci. Niektórzy autorzy identyfikują rzadką postać anestezyjną cholestazy związaną ze zmianami normalnych proporcji składników żółci (zmiany hormonalne, zaburzenia krążenia jelitowo-wątrobowego cholesterolu). Wyróżnia się cholestazę śródwątrobową związaną z upośledzonym wydzielaniem żółci przez hepatocyty lub tworzenie żółci w drogach żółciowych i cholestazę pozawątrobową z powodu niedrożności dróg żółciowych kamieniem, guzem lub podawania leków powodujących cholestazę. W przypadku cholestazy substancje, które są wydalane z żółcią u zdrowych ludzi, wchodzą i gromadzą się w osoczu krwi, a aktywność tak zwanych wskaźnikowych enzymów cholestazy wzrasta. Typowa postać żółtaczki cholestazy charakteryzuje się świądem i żółtaczką.

Cholestaza zwiększa zawartość kwasów żółciowych; bilirubina z przeważającym wzrostem sprzężonej części żółci (cholebilirubina); cholesterol i op-lipoproteiny; aktywność enzymu fosfataza alkaliczna, GGT, 5-nukleotydaza.

Fosfataza alkaliczna (fosfataza alkaliczna) wykazuje aktywność przy pH 9-10, jest zawarty w wątrobie, jelitach, tkance kostnej, ale głównym narządem wydalniczym jest wątroba. W hepatocytach fosfataza alkaliczna jest związana z błonami bieguna żółciowego i mikrokosmków nabłonkowych dróg żółciowych. Przyczynami hiperfermentemii są opóźnione wydalanie enzymu z żółcią i indukcja syntezy enzymów, w zależności od bloku krążenia jelitowo-wątrobowego. Zwiększona aktywność w chorobach wątroby najczęściej wskazuje na cholestazę, w której aktywność enzymu wzrasta o 4-10 dni do 3 lub więcej razy, jak również nowotwory wątroby. Wraz ze wzrostem aktywności fosfatazy alkalicznej powinna być diagnoza różnicowa z chorobami kości.

5-nukleotydaza należy do grupy fosfataz alkalicznych, zmienia się równolegle z nimi, ale wzrost jego aktywności jest związany wyłącznie z cholestazą. Jednak brak dostępnych zestawów komercyjnych nie pozwala na pełne wykorzystanie tego wskaźnika.

GGT Jest to także enzym związany z błoną, a wraz z cholestazą wzrasta dzięki aktywacji syntezy. Badanie GGT z cholestazą uważa się za obowiązkowe.

Zakłócenie wydalania żółci prowadzi do upośledzenia emulgowania tłuszczów i zmniejszenia wchłaniania substancji rozpuszczalnych w tłuszczach w jelicie, w tym witaminy K. Zmniejszenie ilości witaminy K w organizmie prowadzi do zmniejszenia syntezy zależnych od witaminy K czynników krzepnięcia krwi i zmniejszenia wskaźnika protrombiny (PTI). Po domięśniowym podaniu witaminy K z zastojem żółci PI w ciągu dnia zwiększa się o 30%.

3. Zespół wątrobowo-depresyjny obejmuje wszelkie zaburzenia czynności wątroby, którym nie towarzyszy encefalopatia. Zespół występuje w wielu chorobach wątroby, ale jest najbardziej widoczny w procesach przewlekłych. Aby wskazać zespół, stosuje się testy stresowe i określenie stężenia lub aktywności różnych składników surowicy lub osocza.

Testy warunków skrajnych są wrażliwe, ale rzadko stosowane. Obejmują one:

a) testy na funkcję wydalniczą wątroby - bromosulfaleina, indocyjanowa itp.;

b) testy na funkcję detoksykacyjną wątroby - antypiryna, kofeina, szybka próbka.

Badania wykazały, że funkcja syntetyczna jest najmniej stabilna w chorobach wątroby, a synteza tych substancji, które powstają głównie w wątrobie, zmniejsza się przede wszystkim. Dostępne są następujące wskaźniki informacyjne hepatodekrecji:

1. Albumina prawie całkowicie zsyntetyzowany przez wątrobę. Obniżenie jego stężenia obserwuje się u połowy pacjentów z ostrym i 80-90% pacjentów z CAH i marskością wątroby. Hipoalbuminemia rozwija się stopniowo, czego wynikiem może być obniżenie ciśnienia krwi onkotycznego i obrzęku, jak również zmniejszenie wiązania związków hydrofobowych i amfifilowych o charakterze endogennym i egzogennym (bilirubina, wolne kwasy tłuszczowe, leki itp.), Co może powodować zjawiska zatrucia. Informacyjne równoległe oznaczanie albuminy i białka całkowitego. Z reguły całkowita zawartość białka pozostaje normalna lub wzrasta z powodu immunoglobulin (Ig) na tle spadku stężenia albuminy. Redukcja albuminy do 30 g / l lub mniej wskazuje na przewlekły proces.

2 -1-Antytrypsyna - glikoproteina stanowiąca 80-90% frakcji 1-globulina, białko ostrej fazy, syntetyzowane w wątrobie, jest czułym wskaźnikiem zapalenia komórek miąższowych. Wyjątkowe znaczenie diagnostyczne związane z wrodzonym niedoborem białka, prowadzące do ciężkich postaci uszkodzenia wątroby i innych narządów u dzieci.

3. Cholinesteraza (pseudo-cholinesteraza, butyrylocholinesteraza - HE, BChE) surowica, syntetyzowana przez wątrobę, odnosi się do2-globuliny. Jedną z ich funkcji jest rozszczepianie środków zwiotczających mięśnie pochodzących z sukcynylodicholiny (listenon, ditilin). Brak enzymu lub pojawienie się form atypowych komplikuje rozkład leków, co komplikuje proces powrotu do zdrowia po znieczuleniu. Aby zapobiec powikłaniom pooperacyjnym, zaleca się określenie aktywności enzymu i liczby dibukain, tj. stopień zahamowania enzymu dibukainy. W przewlekłych procesach, zwłaszcza marskości wątroby, aktywność enzymu zmniejsza się, a stopień redukcji ma wartość prognostyczną. Inną przyczyną spadku aktywności jest zatrucie fosforoorganiczne.

4. Fibrynogen, I czynnik krzepnięcia, białko ostrej fazy, odnosi się do 2-globuliny. Poziom fibrynogenu zmniejsza się naturalnie w przypadku ciężkich przewlekłych i ostrych chorób wątroby.

5. PTI zmniejsza się z powodu upośledzonej syntezy zależnych od witaminy K czynników krzepnięcia (II, VII, IX, X). W przeciwieństwie do cholestazy poziom IPT nie jest normalizowany przez domięśniowe podawanie witaminy K. IPT jest wskaźnikiem nasilenia ostrych zaburzeń czynności wątroby.

6. Cholesterol spadek krwi u pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby i marskością wątroby, częściej z podostrym wariantem kursu. W przypadku stłuszczenia wątroby poziom cholesterolu może wzrosnąć.

W przypadku przewlekłych chorób wątroby na etapie kompensacji wzrost aktywności enzymów jest nietypowy. Jednak umiarkowany wzrost (o 1,5–3) aktywności transaminaz o wyższym poziomie AST wskazuje na uszkodzenie struktur subkomórkowych, w szczególności MX.

4. Zespół mezenchymalno-zapalny jest spowodowany uszkodzeniem mezenchymu i zrębu wątroby, jest zasadniczo odpowiedzią immunologiczną na stymulację antygenową pochodzenia jelitowego. Zespół ten towarzyszy zarówno ostrym, jak i przewlekłym chorobom wątroby. Markerami zespołu są glob-globuliny, immunoglobuliny, oznaczenie tymolu, przeciwciała przeciwko elementom komórkowym itp.

Definicja -globuliny odnosi się do obowiązkowych testów na wątrobę. Wzrost glob-globulin, które są zasadniczo immunoglobulinami, jest charakterystyczny dla większości chorób wątroby, ale jest najbardziej widoczny w CAG i marskości wątroby. Ostatnio wykazano, że β-globuliny mogą być wytwarzane przez komórki Kupffera i komórki plazmatyczne nacieków zapalnych wątroby. W przypadku marskości wątroby na tle niskiego stężenia albumin, z powodu naruszenia syntetycznej funkcji wątroby, obserwuje się znaczny wzrost α-globulin, podczas gdy stężenie białka całkowitego może pozostać normalne lub podwyższone.

Immunoglobuliny (Ig) są białkami zawartymi we frakcji -globuliny i posiadają właściwości przeciwciał. Istnieje 5 głównych klas Ig: IgA, IgM, IgG, IgD, IgE, ale pierwsze trzy są używane do diagnozy. W przewlekłych chorobach wątroby zawartość wszystkich klas Ig wzrasta, ale wzrost IgM jest najbardziej wyraźny. W przypadku alkoholowego uszkodzenia wątroby obserwuje się wzrost IgA.

Test tymolowy - niespecyficzna, ale przystępna metoda badawcza, której wynik zależy od zawartości IgM, IgG i lipoprotein w surowicy. Test jest pozytywny u 70-80% pacjentów z ostrym wirusowym zapaleniem wątroby w pierwszych 5 dniach okresu żółtaczki, u 70-80% pacjentów z CAH, aw 60% z marskością wątroby. Próbka jest prawidłowa w żółtaczce obturacyjnej u 95% pacjentów.

Przeciwciała przeciwko antygenom tkankowym i komórkowym (jądrowe, mięśnie gładkie, mitochondrialne) pozwalają zidentyfikować składniki autoimmunologiczne w chorobach wątroby.

Dodatkowe metody badawcze obejmują definicję haptoglobiny, orozomukoidy, 2-makroglobulina, 2-mikroglobulina, hydroksyprolina, kwasy uronowe.
Tabela 1.

Diagnostyka biochemiczna chorób

Diagnostyka biochemiczna Diagnostyka biochemiczna (chemia kliniczna (biochemia), patochemia) - kierunek klinicznej diagnostyki laboratoryjnej, której celem jest monitorowanie stanu pacjenta i diagnozowanie chorób poprzez identyfikację składników chemicznych w biomateriale (krew, mocz, w niektórych przypadkach kał, opłucnowy lub mózgowo-rdzeniowy).

Osocze krwi to płyn organizmu o złożonym składzie chemicznym, w tym duża ilość jonów nieorganicznych, enzymów, hormonów, białek, lipidów i węglowodanów, a także rozpuszczonych gazów - dwutlenku węgla i tlenu. Stężenie wszystkich składników krwi u zdrowej osoby mieści się w pewnych granicach, co odzwierciedla normalny stan funkcjonalny zarówno organizmu jako całości, jak i każdej jego komórki oddzielnie. W przypadku różnych chorób dochodzi do naruszenia funkcji narządów i układów, co prowadzi do braku równowagi i koncentracji jednego lub więcej składników krwi. Analiza chemiczna krwi w procesie diagnozy opiera się na tej zasadzie. Lista stanów patologicznych, w których konieczna jest analiza biochemiczna krwi i moczu, jest dość szeroka i obejmuje choroby układu sercowo-naczyniowego, hormonalnego, oddechowego, wydalniczego i innych. Choroby wynikające z niedożywienia są również diagnozowane za pomocą biochemicznych badań krwi. Niedobory pokarmowe można wykryć za pomocą laboratoryjnych metod diagnostycznych.

Określone substancje mogą być również uwalniane do krwiobiegu przez niektóre typy komórek nowotworowych. Rola laboratoriów biochemicznych w monitorowaniu i diagnozowaniu raka ogranicza się do pomiaru poziomu tych „markerów nowotworowych” we krwi.

Bezpieczeństwo i skuteczność terapii lekowej zależy od pomiaru stężenia substancji leczniczych we krwi. A to tylko jeden z aspektów ogromnej roli diagnostyki biochemicznej w monitorowaniu terapii pacjentów.

Obecnie większość badań krwi i moczu przeprowadza się przy pomocy nowoczesnych, zautomatyzowanych systemów diagnostycznych, których biochemiczne analizatory umożliwiają wykonanie do 1000 testów w ciągu 1 godziny, do 20 lub więcej na każdej próbce. A wynik diagnozy większości testów uzyskuje się w ciągu 12-24 godzin. Większość laboratoriów wykonuje określoną listę testów przez całą dobę, ponieważ przy pilnej diagnostyce wyniki testu muszą być gotowe w ciągu 1 godziny.

TAT (lub szybkość diagnostyki laboratoryjnej) to czas od momentu przypisania testu do chwili otrzymania wyniku testu lub od momentu pobrania materiału do momentu otrzymania wyniku testu. TAT powinien odpowiadać szybkości rozwoju procesu patologicznego, a także możliwościom korekty farmakologicznej lub innej.

Niektórzy pacjenci oddziałów, oddziałów intensywnej opieki medycznej i oddziałów intensywnej opieki medycznej często wymagają stałego monitorowania niektórych parametrów krwi. W tych warunkach pielęgniarka tego działu może przeprowadzić pewną ograniczoną listę testów przy użyciu niezbędnego sprzętu znajdującego się w dziale.

ROZDZIAŁ 4 DIAGNOSTYKA BIOCHEMICZNA PROCESÓW PATOLOGICZNYCH I CHORÓB ZWOLNIONYCH

4.1. Patologia sercowo-naczyniowa

W dziedzinie patologii sercowo-naczyniowych biochemia kliniczna odniosła największy sukces w diagnostyce zawału mięśnia sercowego. Metody klinicznej enzymologii i immunochemii pozwalają na zdiagnozowanie zawału mięśnia sercowego w pierwszych godzinach jego wystąpienia, określenie stanu klinicznego niestabilnej dławicy piersiowej, przeprowadzenie diagnostyki różnicowej ciężkiej dławicy piersiowej (niedokrwienia) i śmierci miocytów (anoksji), w celu oceny skuteczności leczenia trombolitycznego i zjawiska reperfuzji.

Zgodnie z zaleceniami WHO rozpoznanie zawału mięśnia sercowego opiera się na typowym obrazie klinicznym ataku bólu w klatce piersiowej; Zmiany EKG; wzrost aktywności krwi enzymów kardiospecyficznych (markerów).

Jednocześnie, przy powtarzającym się zawale mięśnia sercowego, miażdżycy i migotaniu przedsionków, a także w obecności rozrusznika serca (rozrusznika serca) u pacjenta, znacznie trudniej zdiagnozować zawał mięśnia sercowego zgodnie z danymi EKG. Ponadto ponad 25% pacjentów, u których podczas autopsji potwierdzono zawał mięśnia sercowego, nie miało zmian w EKG. Według prospektywnego badania przeprowadzonego w Stanach Zjednoczonych rozpoznanie zawału mięśnia sercowego bez badania kardiospecyficznych markerów śmierci miocytów można przeprowadzić tylko w 25% przypadków.

Wśród pacjentów dostarczonych na oddział intensywnej terapii z bólem serca tylko 10-15% ma zawał mięśnia sercowego. Potrzeba zdiagnozowania zawału mięśnia sercowego we wczesnych stadiach jest podyktowana faktem, że leczenie trombolityczne w pierwszych 2-6 godzinach zmniejsza wczesną śmiertelność średnio o 30%, a terapię rozpoczęto w ciągu 7-12 godzin - tylko o 13%. Terapia trombolityczna po 13-24 godzinach nie zmniejsza śmiertelności.

Wczesne rozpoznanie zawału mięśnia sercowego pozwala na zastosowanie i transluminalną angioplastykę, a skuteczność leczenia zachowawczego jest wyższa, jeśli rozpocznie się jak najszybciej.

Konieczne jest również przeprowadzenie diagnostyki różnicowej zawału mięśnia sercowego z niestabilną dusznicą bolesną, gdy wczesne leczenie może zapobiec zawałowi mięśnia sercowego.

W ostatnich latach arsenał biochemicznych markerów śmierci miocytów został uzupełniony o nowe wysoce specyficzne testy, które pozwalają na zdiagnozowanie zawału mięśnia sercowego w pierwszych godzinach jego wystąpienia. Są to testy, które można zastosować na pierwszym etapie opieki medycznej, a także oznaczenie kardiospecyficznych izoenzymów i markerów białkowych na śmierć miocytów stosowanych na oddziale intensywnej opieki medycznej instytucji medycznych. Jednocześnie sukces technologii przemysłowej i wprowadzenie systemów diagnostycznych opartych na zasadzie „chemii suchej” umożliwiają określenie specyficznych markerów śmierci miocytów w pierwszym etapie opieki medycznej. Jednak nawet w tych warunkach błędy diagnostyczne są możliwe, jeśli patofizjologia zawału mięśnia sercowego i mechanizmy przyjęcia do krwi specyficznych dla narządu i niespecyficznych białkowych markerów śmierci miocytów nie są jasno zrozumiane.

Lokalizacja w komórce ma znaczący wpływ na szybkość uwalniania markera z uszkodzonego miocytu. Enzymy cytozolowe są uwalniane szybciej niż te strukturyzowane na błonach wewnątrzkomórkowych. W przeciwieństwie do markerów cytozolowych, uwalnianie wewnątrzkomórkowego aparatu skurczowego jest wymagane do osiągnięcia przestrzeni śródmiąższowej białek związanych z strukturą, co spowalnia proces pojawiania się markerów we krwi; te ostatnie są uwalniane z enzymów mitochondrialnych.

W badaniu markerów sercowych zawału mięśnia sercowego konieczne jest uwzględnienie szeregu przepisów, zwanych zasadami diagnozowania zawału mięśnia sercowego. Obejmują one: 1) przedziały czasowe; 2) badanie markerów uszkodzenia mięśnia sercowego w dynamice; 3) swoistość organiczna diagnostyki laboratoryjnej zawału mięśnia sercowego; 4) złożony charakter diagnozy; 5) pojęcie „szarej strefy”.

Praktycznie znaczące markery śmierci miocytów to stężenie katalityczne we krwi KK, LDH, AST, fosforylazy glikogenu (GF), wzrost zawartości krwi mioglobiny, łańcuchów miozyny, troponin Ti I. W przypadku uszkodzeń tylko kardiomiocytów (ale nie miocytów mięśni szkieletowych) jest specyficzne stężenia izoenzymów we krwi KK-MB i LDH1, immunochemiczne oznaczanie CK-MB i GF-BB, jak również stosunek izoform izoenzymu CK-MB i troponin.

W diagnostyce zawału mięśnia sercowego ważne jest rozważenie czasu, jaki upłynął od początku dusznicy bolesnej. Wynika to z faktu, że dość długi okres przechodzi od momentu śmierci miocytów do pojawienia się markerów we krwi. Odpływ z komórek dużych cząsteczek białka (CC i LDH) może wystąpić tylko wtedy, gdy integralność błony komórkowej miocytów zostanie zaburzona w wyniku ich śmierci podczas anoksji. Mniejsze cząsteczki markerów białkowych (mioglobina, troponina) mogą wygasnąć w niewielkiej ilości z komórek i w warunkach przedłużonego niedotlenienia z wyraźnymi zmianami w błonie miocytów, przed zniszczeniem komórek. W ciągu pierwszych 4 godzin po zamknięciu tętnicy wieńcowej w strefie maksymalnego niedokrwienia około 60% martwiczych miocytów; martwica pozostałych 40% występuje w ciągu następnych 20 godzin.

Wychodząc poza błonę miocytów, cząsteczki białka przedostają się do płynu pozakomórkowego i przepływają z serca tylko przez przewody limfatyczne. Określa to dość długi okres czasu (3-6 godzin) od chwili śmierci miocytów do pojawienia się markerów kardiospecyficznych we krwi. Przede wszystkim zwiększa się zawartość mioglobiny, GF-BB i troponiny we krwi, a następnie - KK i kardiospecyficzny izoenzym KK-MB, AST; znacznie później zwiększa aktywność LDH i sercowo-specyficznego izoenzymu LDH1 (Rys. 4.1). Kliniczna czułość markerów kardiospecyficznych zależy w dużej mierze od czasu, jaki upłynął od śmierci miocytów. Zatem dla KK-MB, przy wykrywaniu krwi w pierwszych 3-4 godzinach po ataku dławicy, czułość kliniczna (dokładność diagnostyczna) wynosi tylko 25-45% i wzrasta do 98% w zakresie 8-32 godzin.

Rys. 4.1. Dynamika aktywności enzymu w zawale mięśnia sercowego. 1 - MW-2 / MW-1; 2 - MM-3 / MM-1; 3 - KK-MB; 4 - całkowita KK; 5 - LDH1/ LDG2

CK daje wyniki fałszywie ujemne w 32% przypadków, AST - w 49%, mioglobina - w 15%. Aktywność LDH jest wiarygodnym wskaźnikiem śmierci miocytów po 12 godzinach od początku ataku anginy, ale pozostaje podwyższona przez 10-12 dni. Dane dotyczące aktywności markerów kardiospecyficznych w zakresie krótszym niż 4-6 godzin po ataku dusznicy bolesnej mogą prowadzić do błędów diagnostycznych, gdy nawet przy rozległych markerach zawału mięśnia sercowego nie są tak pouczające. Ponadto, tempo wzrostu zawartości markerów sercowych we krwi zależy w dużej mierze od czasu trwania niedokrwienia i czasu rekanalizacji zakrzepowej tętnicy wieńcowej i reperfuzji mięśnia sercowego po zawale serca.

Drugą cechą uwalniania markerów śmierci kardiomiocytów do krwi jest charakterystyczna dynamika wzrostu i spadku ich stężenia (stężenie katalityczne). Jest to determinowane przez ciągłe kurczenie się mięśnia sercowego, co prowadzi najpierw do szybkiej eliminacji białek z martwiczego obszaru mięśnia sercowego, a następnie do całkowitego wypłukiwania białek markerowych do krwiobiegu. Jedynie w zawale mięśnia sercowego zawartość markerów śmierci kardiomiocytów we krwi wzrasta w zakresie 8-24 h. W przypadku niepowikłanego zawału mięśnia sercowego, podobnie zaznaczona jest eliminacja białek markerowych z łożyska naczyniowego. Jednocześnie zawartość każdego ze znaczników „wypisuje” łukową krzywą dynamiczną o różnych parametrach czasowych. W przypadku większości markerów obszar krzywej daje wyobrażenie o wielkości zawału mięśnia sercowego, odzwierciedlając ilość martwiczej tkanki mięśnia sercowego. Aktywność we krwi CC i CC-MB jest już zwiększona wraz ze śmiercią 1 g tkanki mięśnia sercowego.

Pojedyncze badanie AST, KK lub LDH ma względnie niską specyficzność kliniczną - 66%, zwiększenie aktywności enzymów lub zawartość markerów białkowych w ciągu 3-4 godzin zwiększa swoistość diagnostyczną narządu do 86%, trzeci pomiar pozwala na zdiagnozowanie zawału mięśnia sercowego przy użyciu nawet tak specyficznego testu jak definicja AST. Dynamiczne badanie markerów śmierci miocytów umożliwia diagnostykę różnicową między zawałem mięśnia sercowego a hiperfermentemią z masywnymi zmianami mięśni prążkowanych. W okresach 8-24 godzin po ataku stenokardii aktywność enzymów jest tak wskazująca, że ​​jeśli nie ma dynamicznego wzrostu ich aktywności we krwi, to nie ma zawału mięśnia sercowego.

Nie znaleziono absolutnie specyficznych markerów uszkodzenia kardiomiocytów. Specyficzność narządów w diagnostyce za pomocą izoenzymów QA opiera się jedynie na różnicy w stosunku procentowym izoenzymów w poszczególnych narządach i tkankach, aw konsekwencji w surowicy krwi, gdy są one uszkodzone.

Wartość QC-MB. Izoenzym KK-MB jest specyficzny dla mięśnia sercowego nie dlatego, że nie ma takiego izoenzymu w innych tkankach, ale ponieważ jego aktywność w kardiomiocytach wynosi 15-42% całkowitej aktywności QC, podczas gdy jego zawartość w tkance mięśni szkieletowych nie przekracza 4%, i tylko na czerwono, powoli kurczące się włókna mięśniowe. W tych warunkach, z porażką mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych, aktywność CC może być zwiększona w tym samym stopniu, ale w procentach aktywność CC-MB będzie się znacznie różnić. W zawale mięśnia sercowego zawartość CK-MB przekracza 6% całkowitej aktywności CK lub 12 IU / lw temperaturze 30 ° C.

Zarówno w patologii mięśni szkieletowych, jak i śmierci kardiomiocytów we krwi, zwiększa się aktywność KK-MB, ale w pierwszym przypadku jej aktywność nie przekroczy 6% aktywności KK, aw drugim przypadku wzrośnie do 12-20%. Wskazane jest wyrażanie aktywności QC-MB jednocześnie w jednostkach 1 litra (IU / l) i jako procent aktywności QC. Określenie aktywności KK-MB pozostaje najpopularniejszym testem w diagnostyce zawału mięśnia sercowego. W zawale mięśnia sercowego u pacjentów w podeszłym wieku aktywność QC można zwiększyć tylko w niewielkim stopniu, ale ze znacznym wzrostem aktywności QC-MB. U takich pacjentów ważne jest diagnostyczne badanie aktywności CK-MB, nawet przy nie tak znaczącym wzroście aktywności CK.

Podczas operacji na sercu (wady serca, pomostowanie aortalno-wieńcowe) aktywność QC-MB jest wykorzystywana do diagnozowania pooperacyjnego zawału mięśnia sercowego. Natychmiast po zabiegu, z powodu niedotlenienia i uszkodzenia mięśnia sercowego, aktywność KK-MB we krwi wzrasta i wraca do normy w ciągu 10-12 godzin Wraz z rozwojem zawału mięśnia sercowego, aktywność KK-MB wzrasta znacznie i ma charakterystykę charakterystyczną dla zawału mięśnia sercowego.

Wartość LDH. Aktywność LDH1 charakterystyka mięśnia sercowego jako tkanki z beztlenowym typem wymiany. W warunkach przerostu mięśnia sercowego i przewlekłej niedotlenienia synteza LDH1 w kardiomiocytach zaczyna się zwiększać. W zawale mięśnia sercowego, wzrost katalitycznego stężenia LDH we krwi występuje ze względu na wzrost

zawartość izoenzymów LDH1 i LDH2 w stosunku LDH1/ LDG2 więcej niż 1. LDH - enzym cytozolowy; Znaczący wzrost aktywności LDH we krwi podczas zawału mięśnia sercowego występuje później niż QC i AST, w ciągu 1 dnia w polu ataku dusznicy bolesnej; wysoka aktywność LDH1 utrzymuje się przez 12-14 dni. Jest to spadek aktywności LDH we krwi do normy jako test, który wskazuje na zakończenie okresu resorpcji martwiczej tkanki mięśnia sercowego. Jeśli aktywność LDH1, określona metodą bezpośrednią, z zahamowaniem podjednostki przez przeciwciała M przekraczające 100 IU / l, jest to wiarygodny znak zawału mięśnia sercowego.

W przeciwieństwie do podjednostek M i izoenzymów LDH3 (MMNN) LDH4 (HMMM) i LDH5 (MMMM) podjednostka H i izoenzym LDH1 (IUUH) w mniejszym stopniu LDH2 (НННМ), może stosować nie tylko mleczan i pirogronian, ale α-hydroksymaślan jako substrat. To była podstawa propozycji oceny aktywności LDH1 we krwi, przy użyciu α-hydroksymaślanu jako substratu; podczas gdy izozym LDH1 określany jako dehydrogenaza α-hydroksymaślanowa (α-HBDG). W zawale mięśnia sercowego badanie aktywności całkowitego LDH i α-HBDG daje podobne wyniki. Jeśli aktywność LDH we krwi wzrasta w wyniku innego procesu patologicznego, aktywność LDH będzie znacznie wyższa niż aktywność LDH1 i α-HBDG przy braku dynamiki charakterystycznej dla zawału mięśnia sercowego.

W zawale mięśnia sercowego nie stwierdzono istotnej korelacji między aktywnością KK-MB i LDH.1 we wszystkich kategoriach zawału, który występuje w wyniku znacznej różnicy w dynamice i czasie wzrostu aktywności tych izoenzymów we krwi.

Cząsteczki enzymów, które dostały się do krwi po śmierci kardiomiocytów, są patologicznymi składnikami osocza krwi i dlatego muszą zostać usunięte. W zależności od wielkości cząsteczek markerowych, niektóre białka, na przykład mioglobina, są wydalane do moczu lub komórek fagocytujących układu monocytów-makrofagów. Zanim jednak cząsteczki CK-MB i CK-MM zostaną fagocytowane przez makrofagi, ulegają sekwencyjnemu działaniu proteaz we krwi, co powoduje powstawanie izoenzymów CK-MB i CK-MM.

W miocytach izoenzym KK-MM jest reprezentowany przez pojedynczą postać MM-3. We krwi karboksypeptydaza sekwencyjnie rozszczepia końcowe reszty aminokwasowe lizyny z każdego z dwóch monomerów, kolejno tworząc izoformy MM-2 i MM-1. Wyznaczanie izoform KK-MM i KK-MB metodą EF i obliczanie ich stosunku

odczekać 1 godzinę, aby ustalić czas zgonu kardiomiocytów. Stosunek izoform MM i MB zmienia się przed wzrostem aktywności KK-MB.

Enzymodiagnostyka zawału mięśnia sercowego w laboratoriach diagnostyki klinicznej jest złożona. Najpierw określ aktywność AST, KK i LDH, a następnie zbadaj aktywność KK-MB i LDH1. Zintegrowane podejście do diagnostyki enzymów wynika przede wszystkim z faktu, że podczas badania aktywności pojedynczego enzymu można popełnić błąd; po drugie, każdy z tych enzymów różni się znaczeniem diagnostycznym i dynamiką (czas pojawienia się we krwi i szybkość eliminacji z łożyska naczyniowego). Oprócz niedokładności, które mogą być dokonywane na etapach przedanalitycznych (pobieranie próbek krwi do analizy) i analitycznych, istnieją obiektywne powody, które wpływają na wyniki określania aktywności enzymów. Trudności pojawiają się, gdy zawał mięśnia sercowego rozwija się na tle ciężkich chorób somatycznych, z zawałem mięśnia sercowego powikłanym wstrząsem kardiogennym, z posocznicą.

Pomimo klinicznej swoistości aktywności QC w zawale mięśnia sercowego (98%), w niektórych przypadkach zwiększenie aktywności QC i QC-MB nie jest możliwe do wykrycia nawet w warunkach weryfikacji rozpoznania zawału mięśnia sercowego zgodnie z danymi EKG. Dzieje się tak w przypadkach, gdy zawał rozwija się na tle niewydolności nerek i nagromadzenia toksyn mocznicowych (peptydy o średniej cząsteczce), u pacjentów z marskością wątroby i niedostateczną aktywnością detoksykacji hepatocytów, z posocznicą i zatruciem endogennym, z wyraźną kwasicą metaboliczną (lub oddechową). W tych warunkach tak duża liczba niespecyficznych inhibitorów gromadzi się we krwi, że aktywność QC i QC-MB jest praktycznie nieokreślona. W takich przypadkach możliwe jest określenie aktywności QC dopiero po procedurze rozcieńczania surowicy niepopularnej w biochemii klinicznej, gdy spadek stężenia inhibitorów umożliwia pojawienie się aktywności enzymu.

Obecność inhibitorów KK i KK-MB we krwi skłoniła do opracowania immunochemicznej metody oznaczania we krwi nie aktywności katalitycznej, ale zawartości KK-MB według masy cząsteczkowej tej postaci. To znacznie poprawiło czułość metody i odtwarzalność wyników. Chociaż z niepowikłanym zawałem mięśnia sercowego, aktywność KK-MB i zawartość białka KK-MB dobrze się korelują,

możliwe jest określenie zawartości QC-MB we krwi kilka godzin wcześniej niż enzym jest aktywny. Znaczny wzrost poziomu białka CK-MB we krwi odnotowano u połowy pacjentów już po 3 godzinach, a 6 godzin po ataku dusznicy bolesnej odnotowano wysoki poziom białka u wszystkich pacjentów z klinicznym obrazem zawału mięśnia sercowego. Już 90 minut po trombolizie poziom białka KK-MB we krwi wzrasta kilka razy. U pacjentów z niestabilną dusznicą bolesną częściej obserwuje się wzrost zawartości białka CC-MB niż wzrost aktywności izoenzymu. Jednocześnie, pomimo produkcji zestawów diagnostycznych przez różne firmy, kwestia standaryzacji metody określania liczby QC-VM nie została ostatecznie rozwiązana.

Wartość fosforylazy glikogenu. Wśród markerów enzymatycznych i izozymowych w diagnostyce zawału mięśnia sercowego biochemicy kliniczni określają aktywność GF i jego izoenzym GF-BB. GF jest enzymem cytozolowym, który katalizuje usuwanie glukozy z glikogenu w komórce.

W tkankach ludzkich występują trzy izoenzymy GF: GF-LL w wątrobie, GF-MM w miocytach i GF-BB w tkance mózgowej. W ludzkim mięśniu sercowym znajdują się izoenzymy GF-BB i GF-MM, w miocytach mięśni szkieletowych - tylko GF-MM. GF-BB jest najbardziej czułym testem w diagnostyce zawału mięśnia sercowego w ciągu pierwszych 3-4 godzin po ataku dławicy piersiowej. Zgodnie z czułością diagnostyczną w pierwszych godzinach, oznaczenie aktywności GF można porównać tylko z oznaczeniem masy KK-MB we krwi. U większości pacjentów poziom GF-BB znacznie wzrósł już po 4 godzinach po ataku dławicy piersiowej, a niepowikłany zawał mięśnia sercowego powrócił do normy w ciągu 48 godzin.

Wartość mioglobiny. Wśród białkowych markerów zawału mięśnia sercowego najszerzej stosowaną definicją we krwi jest zawartość mioglobiny (MG). MG jest chromoproteiną, która w cytozolu wszystkich komórek mięśniowych transportuje tlen głównie do mitochondriów. Masa cząsteczkowa MG wynosi tylko 18 kD; jego właściwości są podobne w miocytach mięśni szkieletowych i kardiomiocytach. MG jest stale obecny w osoczu krwi w stężeniu poniżej 80 ng / ml. Przy zawale mięśnia sercowego poziom MG we krwi wzrasta 10-20 razy.

• Zwiększone stężenie MG we krwi - najwcześniejszy test w diagnostyce zawału mięśnia sercowego; wzrost poziomu MG we krwi można określić po 3-4 godzinach po ataku dławicy piersiowej. To pierwsza wartość diagnostyczna MG.

• Drugą cechą MG w diagnostyce zawału mięśnia sercowego jest to, że taka mała cząsteczka swobodnie przechodzi przez barierę filtracyjną ciał nerkowych i szybko trafia do moczu. To determinuje naturę zmian zawartości MG we krwi: szybko rośnie i maleje równie szybko. Dopiero przy określaniu MG możliwe jest zdiagnozowanie nawracających zawałów mięśnia sercowego (ryc. 4.2), które rozwijają się kilka godzin po pierwszym epizodzie śmierci kardiomiocytów. Ponadto, w wielu obserwacjach klinicznych zaobserwowano znaczne wahania poziomu MG we krwi pierwszego dnia zawału mięśnia sercowego, gdy wyraźny wzrost w ciągu kilku godzin ustąpił w równie wyraźny spadek. Β W niektórych sytuacjach poziom MG we krwi pozostaje przez długi czas stale wysoki. Obserwuje się to w przypadku wstrząsu kardiogennego, gdy zmniejszenie funkcji skurczowej prowadzi do niedociśnienia, spadku ciśnienia hydrostatycznego nad błoną nerkową i zakończenia

Rys. 4.2. Dynamika stężenia mioglobiny we krwi po wielokrotnym ataku dusznicy bolesnej

filtracja kłębuszkowa, gdy MG nie może być filtrowany do moczu. Jednocześnie istnieje dodatnia korelacja między zawartością MG we krwi dodatnio koreluje ze wzrostem poziomu kreatyniny.

Główną strukturalną jednostką skurczową miocytu jest sarkomer, który tworzą uporządkowane, grube i cienkie włókna. Cienkie włókna zawierają aktynę i kompleks troponiny z tropomiozyną.

Wartość troponiny. Kompleks regulatorowy troponiny w mięśniach prążkowanych składa się z trzech polipeptydów; W rozpoznaniu zawału mięśnia sercowego zawartość tylko troponiny T (Tn T) i troponiny I (Tn I) jest określana we krwi. Każde białko ma trzy izoformy, których synteza jest kodowana przez trzy różne geny. Izoformy mięśnia sercowego Tn T i Tn I (serce Tn T i serce Tn I) stosuje się jako specyficzne markery śmierci kardiomiocytów.

Określenie zawartości Tn T pozwala na rozpoznanie zawału zarówno we wczesnych, jak i późnych okresach. Zawartość Tn T we krwi wzrasta po kilku godzinach po ataku dławicy piersiowej. We wczesnych stadiach zawału mięśnia sercowego czułość kliniczna oznaczania mioglobiny i zawartości KK-MB jest wyższa niż Tn T, ale od trzeciego dnia poziom Tn osiąga plateau, który utrzymuje się ze stopniowym spadkiem przez 5-6 dni. Poziom Tn okazuje się wysoki w okresach niepowikłanego zawału mięśnia sercowego, kiedy poziom aktywności mioglobiny i KK-MB powrócił już do normy, a we krwi pozostaje tylko wysoka aktywność LDH.1. W niektórych przypadkach, przy określaniu Tn T, diagnoza zawału mięśnia sercowego może być dokonana w późniejszym terminie - 8-10 dni po bólu dławicowym. Szczególnie ważne jest zbadanie TI u pacjentów, którzy zostali przyjęci do szpitala 2-3 dni po ataku dławicy piersiowej, gdy wskaźniki KK i KK-MB mogą już powrócić do pierwotnego normalnego poziomu. Ponadto, w porównaniu z KK i KK-MB, zawartość Tn T we krwi wzrasta w większym stopniu, co charakteryzuje wyższą czułość diagnostyczną oznaczania zawartości Tn T we krwi.

Porównawcze badanie Tn T i Tn I ujawniło wyższą czułość diagnostyczną Tn I. Zatem poziom Tn I we krwi podczas zawału mięśnia sercowego może być prawie 100 razy wyższy niż górna granica normy. Przy małym zawale mięśnia sercowego poziom Tn I we krwi wzrasta w większym stopniu niż aktywność CC,

Tabela 4.1. Charakterystyka porównawcza markerów surowicy serca

a Procent lub stosunek QC-MB / całkowita. QC 6 Czas od początku bolesnego ataku zależy od metody

KK-MB i LDG1. Określenie obu postaci Tn T i Tn I jest preferowane w diagnostyce zawału mięśnia sercowego, który rozwija się w okresie pooperacyjnym i po aktywnych działaniach resuscytacyjnych.

Nie ma idealnego markera stanu kardiomiocytów (tabela 4.1). W diagnostyce zawału mięśnia sercowego biochemicy kliniczni mają tendencję do używania najbardziej specyficznych dla narządu izoenzymów i identyfikacji markerów białkowych zawierających tylko komórki mięśnia sercowego. Jednak w diagnostyce zawału mięśnia sercowego w laboratoriach nadal określa się i MG. Jednak w przypadku nieskomplikowanego zawału mięśnia sercowego dynamika niespecyficznego MG we krwi praktycznie powtarza się z kardiospecyficznym CK-MB, który wyprzedza go o 4-6 godzin, a jednocześnie próby określenia zawartości MG w moczu w celu rozpoznania zawału mięśnia sercowego nie powiodły się.

4.2. CHOROBY WĄTROBY

Pomimo wielu procesów biochemicznych zachodzących w komórkach wątroby, nie wszystkie mają wartość diagnostyczną. Wynika to z ograniczonych możliwości metodologicznych laboratorium, niskiego poziomu wiedzy na temat patofizjologii wątroby, a także jednokierunkowych zmian w szeregu testów biochemicznych.

Dominującą wartością w diagnostyce laboratoryjnej chorób wątroby jest określenie aktywności enzymu. Enzymy syntetyzowane przez hepatocyty i komórki nabłonkowe dróg żółciowych można podzielić na wskaźniki, wydzielnicze i wydalnicze. Enzymy wydzielnicze obejmują cholesterazę, jej aktywność we krwi w chorobach wątroby zmniejsza się z powodu naruszenia jej syntezy. Enzymami wydalniczymi są fosfataza alkaliczna, GGT i PAWS. Największą grupą ważnych diagnostycznie enzymów są enzymy wskaźnikowe, w tym ALT, AST, LDH i GLDH. W zakładce. 4.2 przedstawia wskazane enzymy i ich rozkład wewnątrzkomórkowy.

Powszechne w diagnostyce różnicowej choroby wątroby otrzymało metodę porównywania stopnia wzrostu aktywności enzymów o różnej lokalizacji w hepatocytach i odzwierciedlających różne strony czynnościowej aktywności uszkodzeń komórek. Najczęściej stosowany stosunek enzymów przedstawiono w tabeli. 4.3.

Tabela 4.2. Enzymy wątrobowe

Tabela 4.3. Stosunek enzymów wątrobowych

W przypadku chorób wątroby należy stosować współczynnik De Ritis (stosunek aktywności AST / ALT). Stosunek AST / ALT powyżej 2 jest typowy dla zmian wywołanych przez alkohol, a mniej niż 1 dla wirusowego zapalenia wątroby i zespołu cholestatycznego. W większości przypadków wirusowego zapalenia wątroby stosunek AST / ALT pozostawał poniżej 1. W przypadku wirusowego zapalenia wątroby aktywność ALT wzrasta dziesięciokrotnie. W ostrym alkoholowym zapaleniu wątroby aktywność AST jest wyższa niż ALT, podczas gdy aktywność obu enzymów nie przekracza 500-600 IU / L. Pacjenci z toksycznym zapaleniem wątroby, mononukleozą zakaźną, cholestazą wewnątrzwątrobową, marskością wątroby, przerzutami do wątroby, zawałem mięśnia sercowego Aktywność AST jest wyższa niż aktywność ALT. Aktywność AlAT i AST zwiększa się, gdy przyjmuje się erytromycynę, kwas paraaminosalicylowy, cukrzycową kwasicę ketonową, łuszczycę, a także stosuje się ją we wczesnym diagnozowaniu tętniczego zapalenia wątroby.

W diagnostyce różnicowej patologii wątroby ważne jest zbadanie stosunku aktywności izoenzymów LDH. Wzrost względnej aktywności izoenzymu LDH5 charakterystyczne dla uszkodzeń hepatocytów. Hiperfermentemię LDH obserwuje się w różnym stopniu w ostrym wirusowym, lekowym i hipoksyjnym zapaleniu wątroby, niewydolności serca, marskości wątroby i cholestazie pozawątrobowej, jak również w zmniejszeniu oporności osmotycznej erytrocytów i hemolizie. Długotrwały wzrost aktywności izoenzymów LDH5 i LDH4 sugeruje obecność przerzutów do wątroby.

Obecnie w diagnostyce chorób wątroby stabilność systemów koloidalnych jest nadal oceniana za pomocą tymolu i testów sublimacyjnych. Wyniki patologiczne odzwierciedlają wczesne okresy ostrego zapalenia wątroby, toksyczne uszkodzenie wątroby, zaostrzenie przewlekłego zapalenia wątroby. Białka ESP w surowicy krwi dostarczają również dane niespecyficzne, ale pozwalają ocenić naturę procesu patologicznego. Odsetek albuminy, białek ostrej fazy i γ-globulin pomaga w rozpoznaniu patologii wątroby: niska albuminę i wysokie poziomy γ-globulin są charakterystyczne dla marskości wątroby. Zwiększone poziomy γ-globulin we krwi występują również w naciekaniu tłuszczowym wątroby, zapaleniu dróg żółciowych i nowotworach.

Zawartość albuminy w surowicy ma wartość diagnostyczną w ostrych i przewlekłych postaciach zapalenia wątroby. We wszystkich przypadkach ostrego zapalenia wątroby poziom albuminy we krwi pozostaje normalny.

Przewlekłemu zapaleniu wątroby towarzyszy hipoalbuminemia i hipergammaglobulinemia.

Wątroba jest centralnym ogniwem w regulacji krzepnięcia krwi. Hepatocyty syntetyzują fibrynogen, wiele aktywatorów i inhibitorów kaskady reakcji enzymatycznych. Zarówno ostre, jak i przewlekłe zapalenie wątroby zaburza ten przepis. Testy diagnostyczne w kierunku choroby wątroby obejmują wydłużenie czasu protrombinowego, gromadzenie się we krwi produktów niszczenia fibrynogenu. Ostremu uszkodzeniu wątroby towarzyszy zwiększone krwawienie w warunkach hipofibrynogenemii.

Zaburzeniu czynności wątroby towarzyszy zmiana metabolizmu LP. Hipertriglicerydemia jest charakterystyczna dla różnych postaci patologii wątroby. Hipercholesterolemia często występuje, gdy drogi żółciowe są zablokowane, a żółtaczka obturacyjna. W przewlekłym zapaleniu wątroby wolny cholesterol gromadzi się we krwi w wyniku zmniejszenia jego estryfikacji w krwiobiegu. W warunkach wyraźnej cholestazy obserwuje się powstawanie cholestatycznych makroskopowych form LP - LP-X, które tworzą kompleks LP z fragmentem błony plazmatycznej.

W większości przypadków choroby wątroby czynnik etiologiczny pozostaje poza zakresem diagnozy, a biochemicy kliniczni tworzą diagnozę opartą na zasadach diagnozy syndromowej.

Głównymi procesami patologicznymi, które tworzą diagnostykę laboratoryjną choroby, są następujące zespoły:

• cholestaza wewnątrzwątrobowa i pozawątrobowa;

• toksyczne uszkodzenia hepatocytów;

• niewydolność procesów syntetycznych w hepatocytach;

• spowolnienie inaktywacji związków toksycznych;

Zespół cytolizy. Patofizjologiczne podstawy zespołu cytolizy stanowią naruszenie integralności błony komórkowej hepatocytów i ich organelli wraz z rozwojem hiperfermentemii. Ciężka hiperfermentemia, gdy enzymy cytozolowe dostają się do krwioobiegu, jest charakterystyczna dla zakaźnego zapalenia wątroby, leczniczego i toksycznego uszkodzenia wątroby, zatrucia, zdekompensowanej marskości i obwodowego zapalenia miąższu w zapaleniu dróg żółciowych. W enzymodiagnostyce zespołu cytolizy dominuje definicja

Działania ALT, AST i LDH. Zwykle aktywność ALT i AST we krwi nie przekracza 24 IU / l; w granicach 100 IU / L hiperfermentemia jest uważana za „szarą strefę”, która może być spowodowana reaktywnymi zmianami w hepatocytach. Aktywność ALT powyżej 100 IU / l wskazuje na uszkodzenie miąższu wątroby. Wzrost aktywności ALT w 100-200 razy (do 2-6 tysięcy IU / l) odzwierciedla rozległe uszkodzenie hepatocytów w wirusowym zapaleniu wątroby i zatrucie rozpuszczalnikami organicznymi.

Zespół cholestazy wewnątrzwątrobowej i pozawątrobowej. Zespół cholestazy wątrobowej określa naruszenie odpływu żółci z wątroby. Wzrost objętości hepatocytów prowadzi do kompresji przewodów żółciowych, upośledzenia funkcji drenażu. Wypełnienie dużych przewodów żółciowych jest przyczyną cholestazy pozawątrobowej; najbardziej wyraźna cholestaza z żółtaczką obturacyjną. W zakładce. 4.4 pokazuje kombinację testów laboratoryjnych najczęściej stosowanych w diagnostyce różnicowej cholestazy.

Tabela 4.4. Diagnoza cholestazy

Wiarygodne markery zespołu cholestazy wewnątrzwątrobowej to wzrost aktywności ALP, GGT i 5-nukleotydazy we krwi. W błonie nabłonkowej przewodu żółciowego enzymy znajdują się blisko siebie, dlatego wraz ze zniszczeniem błon ich aktywność w krwiobiegu wzrasta jednocześnie i równo.

Reaktywne zmiany w nabłonku dróg żółciowych i błonach plazmatycznych hepatocytów ocenia się na podstawie aktywności fosfatazy alkalicznej. Aktywność fosfatazy alkalicznej pomaga w diagnostyce różnicowej cholestazy wewnątrzwątrobowej i pozawątrobowej. Podczas niedrożności pozawątrobowej (kamienie dróg żółciowych, nowotwór brodawki Vatera) aktywność fosforu alkalicznego wzrasta 10-krotnie lub więcej. Niedrożności śródwątrobowej w zmianach miąższowych (zapalenie wątroby) towarzyszy

oznacza zwiększenie aktywności fosfatazy alkalicznej o 2-3 razy. Ostrej martwicy hepatocytów nie może towarzyszyć wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej, jeśli nie powoduje to kompresji dróg żółciowych (cholestaza wewnątrzwątrobowa). Nie wszystkie procesy patologiczne w wątrobie obserwują zależność między aktywnością fosfatazy alkalicznej a hiperbilirubinemią. We wczesnych stadiach cholestazy wewnątrzwątrobowej wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej jest konsekwencją aktywacji jej syntezy; dalej jego wzrost jest związany ze zniszczeniem kanałów żółciowych pod działaniem kwasów żółciowych.

Zespół cholestazy wewnątrzkomórkowej. Wzrost wielkości hepatocytów i ich uciskanie przewodów żółciowych między segmentami wątroby prowadzi do wystąpienia zespołu cholestazy wewnątrzkomórkowej z umiarkowanym wzrostem aktywności fosfatazy alkalicznej i GGT we krwi i uszkodzeniem nabłonka dróg żółciowych. Wzrost zawartości kwasów żółciowych we krwi jest również wczesnym objawem cholestazy.

Częstym objawem choroby wątroby, której towarzyszy cholestaza, jest gromadzenie się bilirubiny we krwi. Nasilenie hiperbilirubinemii jest niewiarygodne w diagnostyce różnicowej cholestazy wewnątrzwątrobowej i pozawątrobowej. Jednocześnie hiperbilirubinemia ma wartość prognostyczną. Wzrost poziomu bilirubiny jest pięciokrotny typowy dla cholestazy wewnątrzwątrobowej, wzrost stężenia bilirubiny jest 10 razy bardziej charakterystyczny dla ostrego zapalenia wątroby.

Zespół toksycznych uszkodzeń hepatocytów rozwija się na przykład podczas zatrucia alkoholem, gdy nie ma efektów cytolizy, ale alkohol narusza funkcję mitochondriów.

W ostrym zatruciu alkoholem rozwija się zespół toksycznych uszkodzeń formacji subkomórkowych, a integralność błon plazmatycznych w hepatocytach nie jest zagrożona. Metabolity alkoholowe mają działanie toksyczne, w szczególności aldehyd octowy, który powstaje bezpośrednio w mitochondriach. Jednocześnie tworzenie się wysokoenergetycznych związków, w szczególności ATP, jest osłabione w komórce, co ma patologiczny wpływ na procesy detoksykacji związków toksycznych. W ostrym okresie alkoholowego zapalenia wątroby aktywność AST może dominować we krwi z powodu wysokiej aktywności mitochondrialnego izoenzymu AST, a nie cytoplazmy.

Zaangażowaniu hepatocytów w proces patologiczny mitochondriów towarzyszy pojawienie się aktywności GlDG we krwi. Zwiększona aktywność GlDG jest wczesnym testem na alkoholowe zapalenie wątroby, ale 8-10-krotny wzrost aktywności GlDG z umiarkowaną aktywacją AST i ALT jest charakterystyczny dla żółtaczki obturacyjnej. Na toksyczne

wpływ alkoholu charakteryzuje się wyraźnym wzrostem aktywności GGT we krwi bez znacznego wzrostu aktywności fosforu alkalicznego.

Niewydolność syndromu procesów syntetycznych przejawia się zmniejszeniem syntezy białek transportujących hepatocyty, białek układu krzepnięcia krwi, CE.

HE i jego izoenzymy syntetyzują hepatocyty. W warunkach zmiany miąższowej synteza ChE i jej aktywność we krwi ulega zmniejszeniu. Częściej występuje spadek CE we krwi w wyniku działania toksycznego (cytostatyki, insektycydy, fungicydy, fluorki). Fizjologiczny spadek aktywności ChE występuje podczas ciąży. Odnotowuje się rzadkie przypadki genetycznie zdeterminowanego spadku syntezy ChE.

W ostrej niewydolności wątroby hipoglikemia rozwija się u co czwartego pacjenta. W warunkach akumulacji metabolitów pośrednich i rozwoju insulinooporności możliwe jest również wystąpienie hiperglikemii. Przy długotrwałej niewydolności wątroby występuje hiperinsulinemia (zmniejszająca zniszczenie hormonu w wątrobie). W warunkach niedotlenienia i aktywacji beztlenowej glikolizy powstaje kwasica metaboliczna z akumulacją kwasu mlekowego we krwi (kwasica mleczanowa). Kwasica metaboliczna prowadzi do naruszenia stosunku elektrolitów. Porażce miąższu wątroby towarzyszy spadek tworzenia kreatyniny i mocznika. Naturalnie, niewystarczające spożycie białka i zaburzenia trawienia przyczyniają się do tego. Jednak główną przyczyną hipokreatyninemii jest zmniejszenie syntezy kreatyniny w hepatocytach. U pacjentów z zapaleniem wątroby hipokreatynemia jest związana ze zmniejszeniem stężenia kwasu moczowego we krwi.

Syndrom spowolnienia inaktywacji związków toksycznych jest spowodowany hamowaniem ich hydroksylacji w mikrosomalnym aparacie hepatocytów, co zmniejsza szybkość inaktywacji w organizmie wielu leków. W tych warunkach nawet niska dawka terapeutyczna leku może powodować wyraźny efekt uboczny.

Wątroba służy jako bariera biologiczna endogennych i egzogennych związków toksycznych, które pochodzą głównie z przewodu pokarmowego. Ocena funkcji detoksykacyjnej wątroby jest częściej przeprowadzana z przewlekłymi zmianami chorobowymi z zastosowaniem testów stresowych z galaktozą, kwasem fenolotetrabromoftalenosulfonowym, bromocyjanowym zielonym, znakowanymi związkami. Testy obciążeniowe dają możliwość zdiagnozowania przewlekłych postaci choroby, aby ocenić

resztkowe skutki przeniesienia zapalenia wątroby, aby stworzyć koncepcję funkcji wątroby w marskości wątroby, nacieku tłuszczowego wątroby.

W ciężkich sytuacjach śpiączki wątrobowej w ostrym wirusowym zapaleniu wątroby lub nadciśnieniu wrotnym, funkcja detoksykacji wątroby jest oceniana na podstawie ilości amoniaku we krwi. Tworzenie się amoniaku w jelitach zachodzi stale w wyniku aktywności życiowej mikroorganizmów i deaminacji aminokwasów utworzonych z białek pokarmowych. Wśród masywnego krwawienia z żołądka lub żył przełyku zwiększa się powstawanie amoniaku z albuminy krwi.

Zespół zapalny jest spowodowany aktywacją komórek OZE. Charakteryzuje się wzrostem zawartości krwi w białkach ostrej fazy, dysproteinemii z naruszeniem stosunku białek surowicy do elektroforegramu, zmianą próbek osadów (tymol), wzrostem stężenia immunoglobulin.

Pomimo różnorodności tych zaburzeń, stosowanie technik diagnostyki syndromowej jest skuteczne już we wczesnych stadiach choroby wątroby. Oczywiście wyniki badań biochemicznych w procesie diagnostycznym nie są wyjątkowe. Jednocześnie lekarze wykorzystują dane z wywiadu i badania fizykalnego, wyniki diagnostyki radionuklidów, tomografię komputerową i biopsję wątroby. Jednocześnie diagnostyka różnicowa we wczesnych stadiach choroby i ocena charakteru uszkodzenia hepatocytów może być przeprowadzona jedynie na podstawie badań laboratoryjnych, głównie klinicznych danych biochemicznych. Zastosowane kombinacje badań laboratoryjnych przedstawiono w tabeli. 4.5.

Tabela 4.5. Diagnoza chorób wątroby przez enzymy

4.3. PATOLOGIA TKANKI KOŚCI

Główne czynniki regulujące metabolizm fosforanu i wapnia obejmują PTH, kalcytoninę i witaminę D. PTH i kalcytonina utrzymują stałość wapnia w łożysku naczyniowym i płynie pozakomórkowym, wpływają na wchłanianie wapnia w jelicie, wchłanianie zwrotne w nerkach, jelitach i odkładanie się w tkance kostnej. PTH reguluje wapń we krwi, wpływając na wchłanianie wapnia w jelicie i kanalikach nerkowych, mobilizację wapnia z tkanki kostnej. Kalcytonina ma mniej znaczący wpływ, zmniejszając aktywność osteoklastów, zwiększa aktywność osteoblastów, prowadząc do zmniejszenia stężenia wapnia we krwi.

PTH jest polipeptydem, którego jedyny łańcuch składa się z 84 reszt aminokwasowych. Hormon wydziela gruczoły przytarczyczne, prawdopodobnie w postaci nieaktywnego prekursora, z którego powstaje aktywny hormon przez rozszczepienie fragmentu polipeptydu. Aktywny PTH ma krótki okres półtrwania, co stwarza problemy do analizy: stosując metodę radioimmunologiczną mierzy się głównie końcowy fragment karboksylowego hormonu, który ma dłuższy okres półtrwania, ale jest biologicznie nieaktywny.

Działając na nerki, PTH tłumi reabsorpcję fosforu w kanalikach proksymalnych i dystalnych nefronu, zwiększając jego wydalanie, a tym samym obniżając poziom fosforu we krwi (hipofosfatemia). Jednocześnie hormon zwiększa reabsorpcję kanalikową wapnia, zwłaszcza w kanalikach dystalnych nefronu. Działanie PTH w tkance kostnej powoduje mobilizację wapnia i fosforanu, przyczyniając się do występowania osteoporozy i hiperkalcemii. Negatywna hipokalcemia sprzężenia zwrotnego jest głównym bodźcem dla wydzielania PTH, podczas gdy hiperkalcemia hamuje tworzenie hormonu przez gruczoły przytarczyczne. PTH zwiększa również wchłanianie wapnia i fosforu w jelicie, stymulując syntezę 1,25-dihydroksycholekalcyferolu.

W przypadkach nadmiernego wydzielania PTH z gruczolakiem przytarczyc rozwija się wyraźna osteoporoza z obecnością

hiperkalcemia i hipofosfatemia oraz zwiększone wydalanie wapnia i fosforanów z moczem. W tych warunkach reabsorpcja fosforanów w kanalikach jest zahamowana iw konsekwencji zwiększa się jej wydalanie, klirens fosforanu zwiększa się wraz z występowaniem hiperkalcemii w warunkach resorpcji kości wraz z rozwojem osteoporozy. Możesz potwierdzić diagnozę, określając stężenie PTH we krwi. W przypadkach, gdy hipofosfatemii towarzyszy hiperkalcemia, nawet umiarkowany wzrost zawartości hormonów ma znaczenie diagnostyczne.

Należy pamiętać, że w niektórych postaciach nowotworów płuc, nerek, jajników, ektopowe powstawanie PTH występuje w komórkach nowotworowych. Wśród takich warunków konieczne jest rozróżnienie formy krzywicy odpornej na witaminę D. Ta rzadko występująca dziedziczna choroba związana z płcią nazywa się zespołem Fanconiego. Ten ostatni charakteryzuje się wysokim wydalaniem fosforu z moczem, jednocześnie z glukozurią i aminoacidurią bez występowania kwasicy we krwi.

W przewlekłej niewydolności nerek aktywacja syntezy PTH może wystąpić jako mechanizm kompensacyjny w rozwoju hipokalcemii i hiperfosfatemii. Wtórną nadczynność przytarczyc odnotowuje się również w przypadku osteomalacji spowodowanej znacznym zmniejszeniem wchłaniania wapnia w jelicie ze zwiększonym wydalaniem.

Ten stan patologiczny rozwija się najczęściej jako powikłanie operacji na gruczole tarczycy, gdy omyłkowo usuwane są gruczoły przytarczyczne. W tym przypadku poziom wapnia we krwi jest tak niski, że rozwijają się specyficzne objawy hipokalcemii i hiperfosfatemii (objawy Khvostka i Trusso), zmniejsza się wydalanie wapnia i fosforu z moczem. Ten stan wymaga natychmiastowego dożylnego podania chlorku wapnia.

W obrazie klinicznym rzekomej niedoczynności przytarczyc zmiana poziomów fosforanów i wapnia we krwi jest podobna do zmiany pierwotnej niedoczynności przytarczyc, ale jednocześnie zwiększa się zawartość PTH we krwi. Ten stan

charakterystyczne dla choroby genetycznej (choroba Albrighta) związane z niezdolnością komórek kanalików nerkowych do odpowiedzi na hormon.

Drugim hormonem regulującym metabolizm fosforu i wapnia jest kalcytonina. Jednołańcuchowy peptyd z 32 resztami aminokwasowymi wydziela komórki parafollicularne płatów bocznych gruczołu tarczowego. Hormon ten hamuje mobilizację fosforanów i wapnia, podczas gdy ich zawartość we krwi zmniejsza się (hipokalcemia i hipofosfatemia). Wpływ hormonu na nerki nie jest dobrze poznany; sugeruje się, że kalcytonina zwiększa wydalanie kanalików fosforanowych. Ponadto hormon hamuje stymulujące działanie PTH na syntezę 1,25-dihydroksyhaloalkalcyferolu.

ROLA WITAMINY D

Trzecim czynnikiem aktywnie wpływającym na metabolizm wapnia i fosforu w tkance kostnej jest witamina D. Synteza witaminy D w organizmie zachodzi w dwóch etapach hydroksylacji: pierwsza zachodzi w wątrobie, tworząc substancję o ograniczonej aktywności biologicznej; drugi etap występuje w nerkach wraz z tworzeniem się witaminy D3, cholekalcyferol o maksymalnej aktywności biologicznej. Witamina D w jelicie cienkim3 stymuluje wchłanianie fosforu i wapnia, w bliższych częściach rurowej części nefronu aktywuje reabsorpcję obu jonów. Czynniki aktywujące syntezę witaminy D3 w nerkach jest spadek zawartości fosforu we krwi i wpływ PTH.

W warunkach niedoboru witaminy D, ze względu na zmniejszenie zawartości rozpuszczalnych w tłuszczach prekursorów w żywności, niewystarczające promieniowanie ultrafioletowe skóry lub złe wchłanianie, zauważalna jest znaczna hipofosfatemia we krwi. W odpowiedzi na wzrost wydzielania PTH, wchłanianie wapnia i fosforanów w jelicie cienkim i mobilizacja minerałów z tkanki kostnej wzrasta. Przez pewien czas normalizuje to zawartość wapnia we krwi, ale stężenie fosforu może pozostać zmniejszone z powodu zahamowania jego reabsorpcji przez hormon przytarczyc.

W przewlekłej niewydolności nerek rozwija się zespół osteodystrofii nerkowej - złożone naruszenie metabolizmu tkanki kostnej i homeostazy fosforowo-wapniowej. Zmniejszenie kłębuszków

filtracja powoduje hiperfosfatemię, hipokalcemia rozwija się wraz ze zmniejszeniem syntezy nerek witaminy D i odpornością na jej działanie. Hiperfosfatemia może przyczyniać się do rozwoju hipokalcemii z powodu zmniejszenia wchłaniania wapnia w jelicie cienkim, z powodu tworzenia się nierozpuszczalnych apatytów.

METABOLICZNE CHOROBY TKANKI KOŚCI

Właściwe metaboliczne choroby kości dzielą się na osteoporozę, osteomalację, osteodystrofię, niedoskonałość osteogenezy i osteoporozę. Choroby kości mogą również rozwinąć się na tle innej patologii, takiej jak akromegalia lub zwapnienie ektopowe w ścianie naczyniowej (z miażdżycą tętnic i prawidłową z tworzeniem „piasku mózgowego” w nasadce).

Osteoporoza jest najczęstszą metaboliczną chorobą kości. Osteoporoza jest typowa dla wielu chorób, charakteryzujących się uogólnioną utratą tkanki kostnej, która przekracza standardy wieku i płci i prowadzi do zmniejszenia wytrzymałości kości, co powoduje podatność na złamania (spontaniczne lub z minimalnymi uszkodzeniami). Osteoporozę należy odróżnić od osteopenii (atrofia tkanki kostnej związana z wiekiem) i osteomalacji (upośledzona mineralizacja macierzy kostnej).

Czynniki ryzyka osteoporozy obejmują przynależność do rasy kaukaskiej lub mongoloidalnej, predyspozycje rodzinne, masa ciała poniżej 58 kg, palenie tytoniu i alkoholizm, niska lub nadmierna aktywność fizyczna, wczesna menopauza, późny początek miesiączki, brak miesiączki i bezpłodność, przedłużająca się laktacja (ponad 6 miesięcy) ponad trzy ciąże i poród w wieku rozrodczym, a także nadużywanie kawy (ponad pięć filiżanek dziennie), brak spożycia wapnia z pożywienia i przedłużone żywienie pozajelitowe.

Obraz kliniczny w większości przypadków rozwija się stopniowo, zwykle w ciągu kilku lat. W diagnostyce laboratoryjnej ważne jest określenie poziomu fosfatazy alkalicznej (może przejściowo wzrosnąć po złamaniach), wapnia i fosforanu (zwykle normalne). Aktywność resorpcji kości jest określona przez stosunek poziomu wapnia w moczu do stężenia kreatyniny w moczu i stosunku zawartości hydroksyproliny w moczu do stężenia kreatyniny w moczu. Badanie rentgenowskie kręgosłupa ujawnia spadek gęstości kości z akcentowaniem

kontury korowe. Wygląd na zdjęciu radiowym takich odchyleń jest możliwy tylko z utratą co najmniej 30% tkanki kostnej.

Osteomalacja jest patologią szkieletu, która występuje, gdy organiczna matryca kości jest niedostatecznie zmineralizowana. U dzieci jest to krzywica (patrz poniżej), u dorosłych, zaburzenia metaboliczne wapnia, fosforu i witaminy D.

Krzywica - choroba wczesnego dzieciństwa, wynikająca z niedoboru witaminy D, charakteryzująca się zmianami w tkance kostnej z rozwojem deformacji szkieletowych. Wszystkie procesy patofizjologiczne są spowodowane hipokalcemią w wyniku niedoboru witaminy D i jej metabolitów. Występuje kompensacyjna aktywacja gruczołów przytarczycznych i nadprodukcja PTH, która mobilizuje wydalanie wapnia z kości i zwiększa wchłanianie wapnia i soli fosforanowych w jelicie. Występują hipofosfatemia, kwasica metaboliczna i zaburzenia osteogenezy.

Zniekształcająca się osteodystrofia (deformacja osteitis, choroba Pageta) jest chorobą dziedziczną charakteryzującą się deformacją kości udowej i piszczelowej, kręgosłupa i czaszki z ciężką hiperostozą, pogrubieniem i skrzywieniem kości, zwiększoną częstością występowania nowotworów. Zwykle występuje w wieku powyżej 50 lat. Obraz kliniczny jest zwykle bezobjawowy, najczęstszym objawem jest ból kości lub stawu. Rzadziej odnotowuje się zniekształcenia kości, bóle głowy, patologiczne złamania, wzrost temperatury ciała w obrębie dotkniętej chorobą kończyny, niewydolność serca z wysoką pojemnością serca i różne zaburzenia neurologiczne spowodowane uciskiem tkanki nerwowej (z uszkodzeniem czaszki, z których najczęstszą jest głuchota). Laboratorium charakteryzuje się wzrostem fosforu alkalicznego i osteokalcyny w fazie osteosklerotycznej, wzrost poziomu hydroksyproliny w fazie osteolitycznej. Wapń i fosfor w surowicy są zwykle normalne.

Osteodystrofia nerek lub mocznicy jest częstym uszkodzeniem kości, podobnym do osteomalacji, krzywicy lub włóknistego zapalenia kości; odnotowano w przewlekłej niewydolności nerek.

Dziedziczna osteodystrofia Albrighta wynika z oporności komórek docelowych na działanie PTH (pseudohypoparathyroidism). Pacjenci z rzekomą niedoczynnością przytarczyc są oporni na inne hormony działające przez układ cyklazy adenylanowej.

(hormon stymulujący tarczycę, glukagon, FSH, LH). U tych pacjentów obserwuje się charakterystyczny fenotyp, objawiający się brachydaktytycznie, niskim wzrostem, kostnieniem podskórnym. Choroba Albrighta jest często łączona z cukrzycą, nadciśnieniem tętniczym, otyłością, zaburzeniami miesiączkowania (oligomenorrhea), zapaleniem tętnic, zwyrodnieniem stawów. Charakteryzuje się także upośledzeniem umysłowym i drgawkami (z powodu hipokalcemii).

Niedoskonała osteosynteza jest chorobą dziedziczną, która powoduje zmniejszenie masy kostnej (z powodu naruszenia osteogenezy) i powoduje ich zwiększoną łamliwość; często towarzyszy mu niebieskie przebarwienie twardówki, anomalie zębów (niedoskonała zębinogeneza) i postępująca utrata słuchu. Ultradźwięki ujawniają ciężkie postacie płodu od 16 tygodnia ciąży. Diagnozę można przeprowadzić za pomocą badań DNA w biopsji kosmków kosmówki. Leczenie objawowe i ortopedyczne.

Osteoporoza i osteoskleroza są zbiorowe iw praktyce identyczne koncepcje charakteryzujące względny wzrost zawartości tkanki kostnej w kościach, co prowadzi do zmniejszenia objętości jam szpiku kostnego z nieuniknionym upośledzeniem hemopoezy.

Choroba marmuru. Znanych jest kilka dziedzicznych postaci: dominująca dziedziczna choroba Albersa-Schoenberga i formy recesywne to złośliwe, łagodne i śmiertelne formy. Częstotliwość wszystkie formy - około 1: 20000 klinicznie marmurowatość kości w tej patologii przejawia wiele szczelin, zapalenie szpiku, hyperostosis czaszki, przewlekły nieżyt nosa w wyniku zwężenia dróg nosowych, powiększenie wątroby i śledziony (spowodowane przez wyrównawczy pozaszpikową hematopoezę), porażenie nerwu twarzowego, anemii (spowodowane przez zmniejszenie objętości szpiku kostnego) i laboratorium - poprzez zwiększenie poziomu fosfatazy alkalicznej.

4.4. MARKERY WZROSTU ZŁOŚLIWEGO

Nie ma wątpliwości, że sukces leczenia nowotworów można się spodziewać tylko wtedy, gdy nowotwory złośliwe zostaną wykryte na wczesnym etapie rozwoju, jednak kwestia terminowego wykrywania oznak takich patologii nadal pozostaje otwarta.

W ostatnich latach możliwości diagnostyczne onkologów klinicznych znacznie się rozwinęły w związku z zastosowaniem nowoczesnych instrumentalnych metod diagnostycznych: angiopatii i limfografii, diagnostyki radionuklidów, komputera

tomografy termo- i rentgenowskie, rezonans radio-magnetyczny, ultradźwięki z zastosowaniem efektu Dopplera, które pozwalają uzyskać kolorowy obraz guza i ocenić cechy mikrokrążenia. Nowoczesne badania immunomorfologiczne i cytologiczne pozwalają na badanie próbek biopsyjnych nie tylko samego guza, ale także różnych wydzielin (plwociny, moczu, płynu puchlinowego). Obecnie złożona laboratoryjna diagnostyka biochemiczna i immunologiczna opiera się na identyfikacji markerów nowotworowych, hormonów, związków biologicznie czynnych, izoform enzymów, a także metabolitów przebudowy kości w przypadku przerzutowych zmian kostnych.

Początek badania markerów nowotworowych był bardzo zachęcający. Już pod koniec XIX wieku w moczu pacjentów ze szpiczakiem mnogim znaleziono specyficzne białka (immunoglobuliny), zwane białkami Bensa-Jonesa, ale kolejny sukces musiał czekać ponad 80 lat. Jest to związane z odkryciem GI. Abelev i Yu.S. Tataryna α-fetoproteina we krwi pacjentów z wątrobiakiem. Badania te zapoczątkowały nowy etap w badaniach czynników związanych ze wzrostem złośliwych guzów, aw XX wieku doprowadziły do ​​odkrycia szeregu różnych związków, zwanych „markerami nowotworowymi”. Markery są szeroko stosowane przez biochemików klinicznych do identyfikacji pierwotnego guza i jego przerzutów. Markery wzrostu złośliwego obejmują substancje o różnym charakterze. Obejmują one ponad 200 związków: antygeny, hormony, enzymy, glikoproteiny, lipidy, białka, metabolity, których stężenie koreluje z masą guza, jego aktywnością proliferacyjną, aw niektórych przypadkach ze stopniem złośliwości nowotworu. Nieprawidłowa ekspresja genomu jest jednym z głównych mechanizmów wytwarzania markerów przez komórki nowotworowe, co determinuje syntezę embrionalnych, łożyskowych i ektopowych białek, enzymów, antygenów i hormonów.

Jako idealny test do wczesnego diagnozowania nowotworów złośliwych zaproponowano wiele markerów, ale jak dotąd nie znaleziono żadnego rozwiązania. Trudności wynikające z różnorodności wymagań dla idealnego markera. Idealny marker nowotworowy powinien być wytwarzany przez komórkę nowotworową w wystarczających ilościach, aby można go było określić za pomocą nowoczesnych metod. Nie powinien być obecny u zdrowych ludzi i łagodnych guzów,

marker powinien być wykryty we wczesnych stadiach procesu nowotworowego, liczba markerów nowotworowych powinna być wprost proporcjonalna do objętości guza, marker ten powinien być określony przed klinicznymi objawami guza, poziom idealnego markera powinien korelować z wynikami leczenia przeciwnowotworowego.

W badaniach klinicznych stosuje się szereg wystarczająco skutecznych markerów nowotworowych, które jednak nie zawsze w pełni spełniają wszystkie powyższe kryteria. Współczesne metody biochemiczne i immunologiczne mogą ujawnić nowotwory, gdy warunkowa liczba komórek nowotworowych osiągnie 10 9-10 10, a minimalny poziom markera wydzielanego przez guz wynosi od jednego do kilku femtomoli (wszystkie dane dotyczą 1 ml surowicy krwi). Wysoka skuteczność stosowania markerów nowotworowych w klinice może być osiągnięta przez połączenie różnych testów. Należy zauważyć, że liczba proponowanych markerów do diagnozowania i monitorowania nowotworów złośliwych stale rośnie, a następnie następuje etap krytycznej ponownej oceny w celu stworzenia strategii i odpowiedniego zastosowania.

4.4.1. INTERPRETACJA WYNIKÓW BADANIA MARKERÓW TUMOROWYCH

Określenie stężenia markerów nowotworowych w różnych nowotworach wymaga znajomości czynników, zarówno in vivo, jak i in vitro, które wpływają na wyniki lub je zniekształcają. Powinno to być również brane pod uwagę nie tylko lekarzy laboratoryjnych, ale także lekarzy, którzy są bezpośrednio odpowiedzialni za obserwację i proces leczenia konkretnego pacjenta. Poniżej przedstawiono główne czynniki wpływające na definicję markerów nowotworowych.

• stopień ekspresji i syntezy markera;

• uwalnianie markera przez komórki nowotworowe;

• leki i leki chemioterapeutyczne;

• wydalanie z organizmu;

• intensywność dopływu krwi do guza;

• Pozycja ciała pacjenta podczas próby krwi;

• instrumentalne i nieinstrumentalne metody egzaminacyjne (na przykład bronchoskopia lub biopsja);

• katabolizm markerów nowotworowych (na przykład stan czynnościowy wątroby i nerek);

• złe nawyki (palenie, picie alkoholu). In vitro:

• warunki przechowywania próbek;

• przedział czasu między pobraniem krwi a wirowaniem (z oddzieleniem surowicy);

• stopień hemolizy i zażółcenie;

• kontakt naczyń do pobierania krwi ze skórą;

• zanieczyszczenie próbki śliną;

• wpływ narkotyków;

• obecność przeciwciał przeciwko mysim immunoglobulinom we krwi pacjentów (po diagnostycznej immunoscyntygrafii i immunoterapii);

• błąd metodologiczny w oznaczaniu markera nowotworowego. Należy wziąć pod uwagę, że większość krążących

markery nowotworowe krwi nie nadają się do badania przesiewowego pacjentów przy braku objawów, ponieważ istnieje szereg ograniczeń związanych z często niską czułością i swoistością diagnostyczną, a także ograniczoną wartością predykcyjną. Jednocześnie istnieje szereg uznanych przypadków, w których trudno jest zarządzać bez definicji markerów nowotworowych.

Jest to, po pierwsze, ocena skuteczności terapii. We wczesnych stadiach zmiany stężenia markera nowotworowego mogą wykazać, czy wybrana chemioterapia odniesie sukces lub (w przypadku stałego wzrostu stężenia) konieczna jest korekta terapii, aż do odwołania. Oczywiście testowanie markera nowotworowego jest absolutnie bezcelowe w ciężkich przypadkach raka.

Po drugie, monitorowanie przebiegu choroby. Zastosowanie markerów nowotworowych do monitorowania przebiegu nowotworu często umożliwia wykrycie przerzutów i / lub nawrotu nowotworu przez 3-5 miesięcy lub dłużej przed wystąpieniem objawów klinicznych choroby. U niektórych pacjentów badanie markerów nowotworowych po chirurgicznym usunięciu pierwotnego miejsca guza może zapewnić bardziej czułe monitorowanie niż endoskopia, ultrasonografia lub tomografia komputerowa. Szybkość wzrostu poziomu guza

znacznik zwykle pozwala na wyciągnięcie wniosków na temat wielu obserwacji

0 charakter progresji choroby, w szczególności o przerzutach. Znajomość natury zmian poziomu markera nowotworowego pozwala również zoptymalizować czas późniejszego szczegółowego badania pacjenta. Utrzymując niski lub normalny poziom markera nowotworowego przez wystarczająco długi czas, badanie kontrolne, w tym inwazyjne lub drogie techniki, wydaje się zbędne. Wręcz przeciwnie, jeśli poziom markerów nowotworowych wzrasta, a informacje o postępie choroby są konieczne przy podejmowaniu decyzji o taktyce leczenia, takie badania są pokazane.

Po trzecie, identyfikacja resztkowych i nawrotowych guzów. Niewystarczający słaby spadek poziomu markera nowotworowego lub brak spadku na ogół wskazuje na niecałkowite usunięcie guza lub obecność wielu guzów (przerzutów). Informacje tego rodzaju mogą mieć znaczenie terapeutyczne i prognostyczne.

I wreszcie po czwarte, przewidywanie przebiegu procesu nowotworowego. Jest to niezwykle intensywnie rozwijająca się nowoczesna dziedzina stosowania markerów nowotworowych, w szczególności tych, których badania są związane z rokowaniem i odpowiednio wpływają głównie na wybór terapii.

4.4.2. RAK KOLOROWY

W krajach europejskich rak jelita grubego (CRC) choruje

1 na 20 osób. Rzadziej ten rodzaj raka występuje w Afryce i niektórych częściach Azji. Teraz w Rosji współczynnik wykrywalności CRC rośnie monotonicznie.

Obecnie stosowanie metod molekularnych w diagnostyce CRC jest uważane za bardzo obiecujący i ważny obszar badań, wynika to z faktu, że zdarzenia występujące na poziomie genomu powinny być uważane za kluczowe w występowaniu i postępie tych nowotworów. Istnieje wiele wiarygodnych faktów wskazujących, że CRC na wczesnych etapach rozwoju może i musi być identyfikowane metodami molekularnymi. Metody diagnostyki molekularnej CRC pozwalają również przepisać odpowiednie leczenie i dość dokładnie przewidzieć wynik.

CRC rozwija się w wyniku kolejnych zmian (dysplazja / gruczolak-gruczolakorak), które opierają się na genetyce

naruszenia. Jednak mechanizmy odpowiedzialne za występowanie i akumulację takich zaburzeń w komórce nabłonkowej nie są w pełni zrozumiałe. Przykładem trudności w sposobie badania tego problemu jest fakt, że istnieją różnice w częstości występowania łagodnych i złośliwych faz choroby, a mianowicie w sekwencji dysplazji / gruczolaka-gruczolakoraka. Udowodniono, że gruczolaki jelita grubego występują w ponad połowie populacji w 9. dekadzie życia, a CRC rozwija się tylko u 5% populacji. W konsekwencji tylko kilka zmian przedrakowych przekształca się w raka.

Tak więc, wraz ze starością i przewlekłymi chorobami zapalnymi (wrzodziejące zapalenie jelita grubego, choroba Leśniowskiego-Crohna lub zajęcie jelita grubego przez schistosomatozę), CRC u krewnych jest uznanym, jeśli nie głównym, czynnikiem ryzyka. Przyczyny powodujące CRC u jednego członka rodziny mogą się różnić od rzadkich zespołów autosomalnych dominujących z wysoką częstością CRC (rodzinna polipowatość gruczolakowata, dziedziczny zespół CRC bez polipów) do mniej wyraźnych warunków genetycznych, takich jak na przykład wykrycie gruczolaka w najbliższym krewni (rodzic, rodzeństwo lub dziecko). Wiadomo, że CRC pojawiło się w młodszym wieku, im wyższe ryzyko statystyczne jego wystąpienia wśród bliskich krewnych. Dziedziczne zespoły CRC przedstawiono w tabeli. 4.6 według fenotypu i mutacji w odpowiednich genach.

Należy zauważyć, że badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rzadkich zespołów dziedzicznych przyczyniły się do zrozumienia patogenezy sporadycznych CRC, które obserwuje się znacznie częściej w populacji, ale w oparciu o podobne lub podobne zdarzenia molekularne.

Rola zaburzeń genetycznych w pojawieniu się CRC, aw szczególności niestabilności genomu, była ostatnio intensywnie badana. W 1993 r. Niestabilność mikrosatelitarna (MSI) została stwierdzona u członków rodziny z dziedzicznym rakiem okrężnicy (RTC). To odkrycie posłużyło za podstawę hipotez dotyczących mutacji fenotypu raka, opracowanego przez Loeba, zgodnie z którym komórka musi przetrwać wiele mutacji, aby stać się rakową. Ale w tym celu powinna początkowo mieć możliwość mutacji częściej niż normalnie, a to z kolei może

Tabela 4.6. Zespoły dziedziczne CRC

Tabela 4.7. Rodzaje zaburzeń genetycznych i markerów molekularnych w CRC

być związane z dezaktywacją mechanizmów odpowiedzialnych za normalne zachowanie struktury DNA.

W prawie wszystkich przypadkach RTK stwierdza się niestabilność chromosomową lub niestabilność MSI. W rzeczywistości istnieje odwrotna zależność między tymi dwoma naruszeniami. Zatem nowotwory złośliwe, które mają niestabilność MSI, są zwykle diploidalne i nie mają aberracji chromosomowych. Guzy z niestabilnością chromosomową charakteryzują się aneuploidią i często towarzyszy im utrata lub pojawienie się dodatkowych chromosomów. Tak częste wykrywanie niestabilności chromosomowej lub niestabilności MSI w tym przypadku nie wskazuje, że jest to bardzo powszechne i niespecyficzne zjawisko w procesie wystąpienia jakiegokolwiek złośliwego guza, ale niestabilność genomu jest ściśle związana z nowotworem.

Zarówno niestabilność chromosomów, jak i niestabilność MSI można wykryć w bardzo wczesnych stadiach RTK. Wykorzystując porównawczą hybrydyzację genomu do określenia średniej liczby błędów podczas kopiowania, byliśmy w stanie wykazać ich stopniowy wzrost wraz z postępem gruczolaka z łagodną dysplazją do gruczolaka z ciężką dysplazją i późniejszą transformacją w raka (Tabela 4.8).

Tabela 4.8. Niestabilność chromosomowa w przypadku RTK

U pacjentów z wrodzoną predyspozycją z powodu zaburzeń genu APC, w tym zaburzeń sekwencji nukleotydów i ekspresji genów, rozwijają się guzy, zwykle rozwijające się w wyniku niestabilności chromosomowej, która charakteryzuje się utratą alleli i zaburzeniami cytogenetycznymi. Guzy u niektórych pacjentów z sporadycznym CRC występują w ten sam sposób.

Natomiast u pacjentów z dziedzicznym zespołem CRC nepolipozy mutacje w genie korygującym błędy DNA powodują guzy charakteryzujące się niestabilnością MSI i nukleotydy wykrywane jako powtarzające się sekwencje nukleotydowe, z których niektóre znajdują się w kodonach genów. Utrata alleli jest rzadko obserwowana. Ten typ patologii molekularnej obserwuje się również w około 15% przypadków sporadycznych CRC i często wiąże się z cechami anatomicznymi, takimi jak lokalizacja w bliższym jelicie (okrężnica wstępująca); niskie różnicowanie komórek nowotworowych ze składnikiem śluzowym, rdzeniowym lub pierścieniowokomórkowym; obecność znacznej liczby pęcherzyków limfoidalnych z centrami kiełkowania na obrzeżach guza; naciek guza limfocytów.

Nieefektywna transkrypcja genów w wyniku nieprawidłowej metylacji cytujących sekwencji guaninowych (wysp C-G) w regionach promotorowych genów jest obecnie uważana za jeden ze składników molekularnej patogenezy trzeciego podgatunku CRC.

Zastosowanie molekularnych metod diagnostycznych u pacjentów ma ogromny potencjał zarówno we wczesnej diagnostyce, jak i ocenie odpowiedzi guza na terapię oraz w prognozowaniu choroby. Jak pokazano w tabeli. 4.9, przy takiej diagnozie można użyć różnych przedmiotów badań.

U tych pacjentów, którzy już mają CRC, metody molekularne mogą być stosowane do identyfikacji mikroprzerzutów, aby dokładniej ocenić etap procesu nowotworowego, w szczególności do wykrywania mikroprzerzutów w węzłach chłonnych lub do oceny możliwego krwiotwórczego rozsiewu komórek nowotworowych w szpiku kostnym.

Ponadto diagnostyka molekularna ma ogromny potencjał w wykrywaniu genotypowych i fenotypowych cech nowotworu, które określają cały łańcuch zdarzeń prowadzących do przerzutów komórkowych, tak zwanych przerzutów

Tabela 4.9. Zastosowanie molekularnych metod diagnostycznych w CRC

genotyp i fenotyp. Markery tego typu mogą wskazywać na większe prawdopodobieństwo postępu procesu nowotworowego po radykalnej operacji.

Zidentyfikowano nieprawidłowości genetyczne związane z przewidywaniem lub odpowiedzią na chemioterapię CRC, w tym utratę allelu przy 18q, zanik ekspresji produktu genu DCC, nieprawidłowości w genie p53, utratę alleli na krótkim ramieniu chromosomu 1 i 5, mutacje RAS. Badania skuteczności klinicznej stosowania takich markerów molekularnych zostały przekonująco sformułowane, są obecnie prowadzone i obejmują reprezentatywną próbkę populacji. W celu powszechnego stosowania w praktyce klinicznej badania markerów molekularnych muszą spełniać wszystkie wymagania rutynowych badań laboratoryjnych, takich jak odtwarzalność, dostępność i odpowiednia kontrola jakości. Wreszcie wyniki badań markerów molekularnych powinny być łatwo interpretowane przez lekarzy i mieć wartość terapeutyczną.

Złożoność i wielostopniowe procesy genetyczne i biochemiczne zachodzące w komórkach nowotworowych, które umożliwiają im przerzuty, utrudniają interpretację wartości takich markerów. Ponadto czynniki niezwiązane bezpośrednio z guzem, takie jak jakość techniki chirurgicznej, znacząco wpływają na wynik końcowy. Wśród genów markerów nowotworowych, które przewidują odpowiedź terapeutyczną, skupiono uwagę na genach p53 i regulowanych przez apoptozę, które są regulowane przez p53.

Jednym z obszarów molekularnego badania genetycznego guzów jest identyfikacja zaburzeń molekularnych charakterystycznych dla późniejszego rozwoju guzów metachronicznych, czasami błędnie uważanych za nawrót głównego guza. Takie badania obejmują badanie gruczolaków jelita grubego jako celu identyfikacji genu markerowego z powodu ich wysokiej częstości w populacji jako zmiany przedrakowej w porównaniu z niską częstością wykrywania nowotworów złośliwych. Molekularny marker wskazujący na wysokie prawdopodobieństwo rozwoju gruczolaków metachronicznych, zwłaszcza gruczolaków, zdolnych do przekształcenia się w nowotwór złośliwy, może być przydatny do identyfikacji grup ryzyka do późniejszych badań przesiewowych kolonoskopowych.

W przeciwieństwie do tych pacjentów, u których gruczolaki metachroniczne są mało prawdopodobne, mogą zostać wykluczone z badań przesiewowych. Strategia usuwania gruczolaka wykazała, że ​​wiąże się to ze zmniejszeniem częstości CRC, a markery molekularne, które identyfikują pacjentów z wyższym ryzykiem, mogą być przydatne.

Badanie próbek stolca i krwi ma również ogromny potencjał. Tak więc, zastosowanie bardzo prostego testu na ukrytą krew w kale zmniejszyło śmiertelność z powodu CRC, ale jego specyficzność pozostaje stosunkowo niska. Testy molekularne do wykrywania w odchodach fragmentów DNA guza są bardziej progresywne. Szereg badań wykazało, że DNA zawierające mutacje można zidentyfikować w kale i krwi pacjentów z guzami z tymi mutacjami. Diagnoza guzów, badania przesiewowe i dynamiczna obserwacja pacjentów mogą znacznie poprawić, jeśli pewne trudności techniczne zostaną przezwyciężone, a ich koszty zrównoważone.

Obecnie naukowcy przywiązują dużą wagę do badania perspektyw wykorzystania molekularno-genetycznych markerów CRC. Poniżej znajduje się krótka charakterystyka markerów nowotworowych, które są obecnie najczęściej stosowane w praktyce klinicznej.

Po raz pierwszy w 1965 r. Gold i Freedman odkrył antygen nowotworowo-zarodkowy (CEA) w badaniu ludzkiej tkanki żołądkowo-jelitowej i gruczolakoraka okrężnicy. Później wykryto CEA w surowicy pacjentów z CRC. Te pierwsze prace były bardzo zachęcające. Wtedy wielu wydawało się

wysoce specyficzny test do diagnostyki RTK. Jednak później, w miarę poprawy metod wykrywania CEA i gromadzenia danych klinicznych, marker ten mógł być izolowany także w innych nowotworach (rak trzustki, wątroby, płuc, tarczycy i nerwiaka niedojrzałego), jak również w chorobach nienowotworowych (marskość wątroby, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, zapalenie trzustki, przewlekłe zapalenie oskrzeli, rozedma płuc, wirusowe zapalenie wątroby, zapalenie uchyłków, polipy, niewydolność nerek). Dlatego w wykryciu CEA nie można całkowicie stwierdzić, że pacjent ma tego typu raka. Jednocześnie CEA jest nadal markerem pierwszego wyboru dla CRC i jest stosowany z wysoką skutecznością w monitorowaniu choroby, ale główną uwagę zwraca się na parametry ilościowe metody.

U 99% zdrowych osób poziom CEA jest mniejszy niż 5 ng / ml. W przypadku CRC czułość testu waha się od 25 do 80% i zależy od wielkości i stopnia zróżnicowania guza, a także od zakresu procesu. Poziom CEA koreluje z etapem procesu nowotworowego. Tak więc, według podsumowanych danych różnych autorów, zgodnie z etapami według klasyfikacji Dukesa, wzrost jego stężenia był typowy dla antygenu: w stadium A - 7,8 ng / ml, B - 30,3 ng / ml, C - 58,1 ng / ml, D - 134,3 ng / ml. Jednocześnie częstość wykrywania CEA (przy progu markera 5 ng / ml) w grupach pacjentów ze wskazanymi etapami wzrosła i odpowiadała 3, 25, 45 i 65%, a przy wartości progowej markera> 2,5 ng / ml stwierdzono jeszcze częściej z powyższym Etapy książąt i odpowiadały 28, 45, 75 i 84%. Biorąc pod uwagę fakt, że w stadium A i B marker nowotworowy był zwiększony tylko u 3-28% pacjentów, jego zastosowanie we wczesnej diagnostyce CRC jest problematyczne. Wysoce zróżnicowane guzy aktywniej wytwarzają CEA.

Według wielu autorów marker ma wartość prognostyczną, co wynika z faktu, że wysoki początkowy poziom CEA w surowicy krwi (ponad 25 ng / ml) wskazuje na wysokie ryzyko wczesnego nawrotu CRC po chirurgicznym usunięciu guza.

Jednym z przykładów zastosowania CEA jest określenie radykalnego charakteru interwencji chirurgicznej w CRC. Z reguły po radykalnym chirurgicznym usunięciu guza pod koniec 6 tygodnia stężenie antygenu staje się poniżej normy. Jeśli poziom markera nie spada po usunięciu guza pierwotnego,

myśleć, że pacjent ma przerzuty. Zaleca się określenie CEA u pacjentów w okresie pooperacyjnym po 3 miesiącach przez 2 lata. Regularne monitorowanie pacjentów z CRC z włączeniem CEA poprawia 5-letni wskaźnik przeżycia. Chemioterapia uzupełniająca (5-fluorouracyl i lewamizol) u pacjentów z CRC może powodować przemijające zwiększenie poziomu CEA w surowicy krwi. Nie zaleca się rutynowego określania CEA w monitorowaniu odpowiedzi na leczenie, jednak nie ma alternatywnych testów oceniających odpowiedź na leczenie u pacjentów z CRC.

U większości pacjentów z RTK (79,1%) w porównaniu z grupą kontrolną (10%) wykryto przeciwciała IgM i IgG przeciwko CEA, co pozwala również na zastosowanie tego wskaźnika jako markera diagnostycznego i niezależnego czynnika prognostycznego. Jednocześnie wykrycie przeciwciał przeciwko CEA w surowicy pacjentów z CRC wiąże się z lepszym rokowaniem i znaczącym wzrostem wskaźnika przeżycia 2-letniego.

Analiza poziomu CEA w płukaniach okrężnicy przed rutynowym badaniem endoskopowym wykazała, że ​​ten prosty test może być przydatny w medycynie praktycznej do identyfikacji grup pacjentów z wysokim ryzykiem CRC.

Zastosowanie CEA do celów diagnostycznych jest ograniczone jego niską specyficznością, ze względu na wzrost stężenia antygenu w surowicy w chorobach nienowotworowych, jak również wpływ pewnych czynników egzogennych i endogennych na syntezę tego markera. Dlatego podczas badania pacjentów z guzami okrężnicy, CA-19-9 jest używany jako marker drugiego wyboru (patrz poniżej). Ma to szczególne znaczenie w przypadku nowotworów z ujemnym wynikiem REA.

Biorąc pod uwagę niską czułość i specyficzność, nie zaleca się również stosowania definicji CEA w badaniach przesiewowych CRC. W przypadku 5-krotnego wzrostu CEA w surowicy i obecności dolegliwości klinicznych u pacjenta należy zasugerować CRC.

Analiza porównawcza trzech markerów nowotworowych (CA-19-9, CEA i α-fetoproteiny) w surowicy pacjentów z RTK na różnych etapach procesu nowotworowego u pacjentów z przewlekłym wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego iu zdrowych osób wykazała istotną różnicę między pacjentami z miejscowym RTK a przewlekłym wrzodziejące zapalenie jelita grubego w odniesieniu do CA-19-9 i CEA, jak również między zlokalizowanym i uogólnionym RTK dla powyższych dwóch

markery nowotworowe. Wartości markerów nowotworowych w przewlekłym wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego nie przekraczały wartości normalnych. W zlokalizowanym procesie poziom CA-19-9 nie przekracza 1000 jednostek / ml, CEA - 20 ng / ml. Parametry α-fetoproteiny u pacjentów z CRC mieszczą się w normalnym zakresie i z reguły zwiększają się tylko wtedy, gdy proces nowotworowy jest uogólniony, co nie pozwala na użycie tego markera w diagnostyce choroby. W przypadku stosowania złożonego CA-19-9 + REA czułość diagnostyczna wynosi 91% i znacznie przewyższa czułość przy użyciu tylko jednego markera nowotworowego. Przystąpienie do instrumentalnych metod diagnostyki danych dotyczących definicji markerów nowotworowych (CA-19-9 i CEA) zwiększa częstotliwość wykrywania zlokalizowanego CRC o 14%, a podczas generalizacji procesu - o 9%.

Dla guzów charakteryzujących się brakiem równowagi między procesami proliferacji i apoptozy. Endotelina-1, polipeptyd o 21 resztach aminokwasowych, ma działanie zwężające naczynia i aktywność mitogenną, a także bierze udział w mechanizmach regulacji apoptozy. Eksperyment wykazał, że endotelina-1 jest czynnikiem przetrwania i może in vitro chronić komórki PTK przed apoptozą indukowaną FasL.

Częstotliwość wykrywania i poziom rozpuszczalnego antygenu Fas (sFas) - inhibitora apoptozy - w surowicy pacjentów z RTK jest wyższa niż u osób praktycznie zdrowych. Występowała tendencja do wzrostu zawartości sFas w surowicy u pacjentów z RTK z przerzutami w regionalnych węzłach chłonnych i wątrobie, co umożliwia omówienie roli systemu Fas / FasL jako możliwego celu terapii przeciwnowotworowej u pacjentów z CRC.

Wykazano, że wysoka aktywność kaspazy-3 koreluje z wysokim ryzykiem nawrotu RTK, szczególnie w przypadkach jego prawostronnej lokalizacji. Wykryto również korelację aktywności kaspazy-3 z komórkami filtrującymi nowotwór CD57 +.

Ważną rolę w mechanizmach regulacji apoptozy w PTK odgrywa bcl-2, który jest zwykle wyrażany przez komórki wyścielające dno krypt okrężnicy. Wykazano, że ekspresja bcl-2 w stadium RTK Dukesa w fazie B wiąże się z lepszym przeżyciem pacjentów, a zatem dla pacjentów, u których guzy nie wyrażają bcl-2, wskazane jest leczenie uzupełniające.

Ekspresja immunoreaktywnego p53 w pierwotnym guzie w CRC jest markerem wysokiego ryzyka nawrotu choroby po chirurgicznym usunięciu choroby i częściej po pierwszym roku obserwacji. Jednocześnie zwiększona ekspresja p53 została wykryta w 47, a CEA w 34,4% guzów. Uważa się, że podczas oceny prognozy CRC konieczne jest zdefiniowanie obu znaczników.

Wiadomo, że uszkodzenie genetyczne odróżnia pierwotne raki bliższej i dalszej okrężnicy. Zatem wielowymiarowa analiza ekspresji p53 w pierwotnym CRC częściej ujawnia zwiększoną ekspresję p53 w dystalnym (58,5%) niż proksymalnym (41,7%) RTK. Jednocześnie okres bez nawrotów jest mniejszy w guzach p53 + (odpowiednio 75 i 38%; p = 0,006). Wysokie ryzyko nawrotu CRC stwierdzono wśród guzów p53 + z ich dystalną lokalizacją. Dlatego ocena ekspresji p53 w CRC może służyć jako marker wczesnego nawrotu choroby i jest związana z lokalizacją guza w narządzie.

Udowodniono, że niepowodzenie chemioterapii w CRC jest związane z opornością wielolekową tych guzów. Wykazano, że ekspresja różnych izoform CD44 jest związana z agresywnym zachowaniem nowotworu i rodzi pytanie, czy sygnał z tego receptora moduluje wrażliwość na lek guza. Udowodniono również, że CD44 indukuje aktywację rodzin kinaz tyrozynowych LYN i Akt. Zdolność do hamowania apoptozy może odgrywać kluczową rolę w rozwoju nowotworów okrężnicy, co wiąże się z ekspresją CD44.

Aktywatory i inhibitory plazminogenu

W ostatnich latach badania metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej, które są ściśle związane z procesami inwazji i przerzutów nowotworów, przyciągnęły uwagę naukowców. Wraz z rozwojem przerzutów powinien istnieć łańcuch kolejnych zdarzeń prowadzących do uwolnienia komórek nowotworowych z ich pierwotnego środowiska i tworzenia guzków nowotworowych w odległych narządach i tkankach. Zakłada się, że w celu zapewnienia procesów inwazji i przerzutów potrzebny jest złożony łańcuch proteolityczny, w tym różne proteazy. Uważa się, że plazmina, która zmniejsza poziom glikoprotein macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywuje niektóre prometalloproteazy, odgrywa kluczową rolę w procesach inwazji i przerzutów, podczas gdy

w wieloetapowym łańcuchu proteazy kluczową pozycją jest proteaza serynowa - aktywator plazminogenu typu urokinazy (uPA), ponieważ katalizuje tworzenie plazminy z jej prekursora plazminogenu. Receptor IRA (Pc-uPA) również odgrywa ważną rolę, ponieważ gdy uPA wiąże się z receptorem, jego zdolność do aktywacji plazminogenu wzrasta. Z drugiej strony, inhibitory uPA - PAI-1 i PAI-2 mogą być obecne w tkankach PTK. Wykazano, że poziomy uPA i PAI-1 w CRC są wyższe niż w homologicznej normalnej tkance i łagodnych nowotworach.

Pytanie, czy uPA w ludzkim RTK pochodzi z samych komórek nowotworowych, czy z elementów otaczającego zrębu (fibroblastów, makrofagów, leukocytów) pozostaje przez długi czas bez odpowiedzi. W końcu Harvey i in. możliwe było udowodnienie, że aktywator pochodzi z samych komórek nowotworowych i nie jest zapożyczony z elementów zrębu, a antygen jest najintensywniej wykrywany w szczytowych i podstawowych obszarach komórek PTK.

Najbardziej reprezentatywne badanie składników systemu aktywacji plazminogenu w próbkach CRC zostało przeprowadzone przez Fujii i in. Przeanalizowali także ekspresję genów uPA i PAI-1 przy użyciu metody PCR. Ekspresję UPA wykryto w 58,8% nowotworów. U pacjentów z dodatnim uPA i ujemnymi wynikami dla PAI-1 rokowanie 5-letniego przeżycia było istotnie gorsze. Analiza wieloczynnikowa wykazała, że ​​wyniki jednoczesnego oznaczania uPA i PAI-1 w CRC są niezależnymi wskaźnikami prognostycznymi.

Przeżycie pacjentów po operacji nie korelowało z zawartością uPA w zrębie guza, jednakże odnotowano wzorzec związany z jego poziomem w nabłonku guza, tj. Określenie poziomu uPA może być testem do diagnozowania RTK bez przerzutów, jak również ryzykiem wczesnego nawrotu po operacji. Możliwe jest, że proteazy mogą być celem leków, które zapobiegają inwazji i przerzutom CRC.

Przerzuty do wątroby są ważnym czynnikiem ograniczającym rokowanie u pacjentów z RTK. Istnieje korelacja między iRA a przerzutami do wątroby. Transdukcja genu tPA w komórkach PTK może być pomocna w przeciwdziałaniu przerzutom do wątroby.

Za najmniej zbadany w sensie klinicznym składnik systemu aktywacji plazminogenu uważa się za Rc-uPA, który jest związanym z błoną trójdomenowym glikopeptydem. To

receptor może również występować w postaci rozpuszczalnej (rRc-uPA) w ekstraktach z guza, jak również w osoczu krwi zarówno osób zdrowych, jak i pacjentów chorych na raka. Rozpuszczalna Rc-uPA w osoczu jest praktycznie niezmienioną cząsteczką, jednak ani dokładny mechanizm jej uwalniania z powierzchni komórki, ani jej funkcja biologiczna, nie zostały w pełni zbadane. Podwyższone poziomy rR-uPA w osoczu wykryto u pacjentów z RTK, a stężenie rR-uPA jest związane z rokowaniem choroby. Możliwe jest, że Pc-uPA może znacząco przyczynić się do wzmocnienia angiogenezy wokół guza, jak również do przerzutów mikronaczyniowych.

Zatem, zwiększona ekspresja Rc-uPA, która charakteryzuje inwazyjność guza in vitro w co najmniej niektórych subpopulacjach komórek RTK, jest częściowo wynikiem stałej aktywacji kaskady sygnałowej zależnej od kinaz białkowych aktywowanych mitogenami.

Receptory czynników wzrostu

Jednym z ważnych systemów regulacyjnych do przekazywania sygnału mitogennego jest rodzina receptorów kinazy tyrozynowej - produkty grupy onkogenów c-erbB, która obejmuje cztery receptory transbłonowe o podobnej strukturze - receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EPRF lub ErbB1), a także ErbB2 (HER2 / neu), ErbB3 (HER3) i ErbB4 (HER4). Oprócz struktury, receptory te różnią się względną specyficznością i powinowactwem do różnych typowych ligandów. Po aktywacji w wyniku wiązania i dimeryzacji liganda, wewnętrzna receptorowa kinaza tyrozynowa jest aktywowana i uzyskuje zdolność do fosforylacji zarówno samego receptora, jak i innych białek komórkowych zaangażowanych w przekazywanie sygnału mitogennego.

Różne czynniki wzrostu biorą udział w autokrynnej i parakrynnej regulacji proliferacji komórek CRC. W ostatnich latach znaczenie kliniczne receptorów czynników wzrostu i ich ligandów było aktywnie badane w CRC, głównie RESR, receptorze insulinopodobnego czynnika wzrostu typu 1 (RIGR-1), receptorze czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (R-VEGF).

REFR jest produktem onkogenu c-erbB1, który jest transbłonową kinazą tyrozynową, najbardziej badanym pod względem klinicznym markerem tej grupy w nowotworach o różnej lokalizacji, ale niewystarczająco zbadanym w CRC.

Receptory rodziny ErbB mogą tworzyć zarówno homo jak i heterodimery, aw wielu przypadkach najbardziej aktywne są heterostruktury z udziałem drugiego przedstawiciela tej rodziny, HER2 / neu, który nie ma własnego liganda. Zatem HER2 / neu jest kluczowym elementem w przekazywaniu mitogennych sygnałów czynników wzrostu podobnych do EGF, a jego blokowanie może znacznie spowolnić lub zatrzymać wzrost guzów zależnych od takich bodźców. Uważa się, że zwiększona ekspresja HER2 / neu w nowotworach, w tym CRC, może służyć jako marker czułości i cel skuteczniejszej bioterapii tych nowotworów. Trwają badania kliniczne, aw literaturze przedstawiono wstępne badania nad ekspresją HER2 / neu w prognozowaniu nowotworów przewodu pokarmowego.

RIFR-1 i RIFR-2 to potencjalne mitogeny i silne stymulatory wzrostu komórek nowotworowych. Mediuje się działanie obu typów FGID stymulujące wzrost, głównie przez FGED-1. Dotychczas nie ma jednej opinii na temat klinicznej wartości RIFR-1 w CRC.

Większość badań wykazała odwrotną zależność między odkryciem receptorów hormonów steroidowych (typu endokrynnego regulacji) a EGFR (auto i parakrynnym rodzajem regulacji) w guzach.

Blokowanie któregokolwiek z etapów mitogennej transmisji sygnałów czynników wzrostu może, w zasadzie, prowadzić do rozregulowania proliferacji komórek nowotworowych i potencjalnie do hamowania wzrostu guza. Eksperyment badał już wystarczająco dużą liczbę leków, które wpływają na powyższe procesy: specyficzne i niespecyficzne blokery wiązania EGFR z ligandami, inhibitory kinazy tyrozynowej i innych kinaz, blokery wiązania domen SH2 białek efektorowych z aktywowanym receptorem, związki, które tłumią aktywację genu ras, w tym inhibitory farnezylacji. Większość z nich znajduje się na etapie badań klinicznych, chociaż niektórzy, w szczególności Herceptin, przeszli już próby kliniczne i okazali się dość skuteczni w niektórych typach nowotworów.

Wiadomo, że RTK są docelowymi tkankami hormonów steroidowych iw 25-60% przypadków zachowują funkcjonalną zdolność podstawowego ogniwa mechanizmu działania jednego lub kilku steroidów, mianowicie receptorów estrogenowych (RE; 40,9%), androgenów (RA; 15,5% ), progesteron (RP; 32,6%) i glukokortykoidy (WG; 59,1%).

Jednak tylko obecność ER i RP w guzie może być stosowana jako kryterium korzystnej prognozy 10-letniego przeżycia pacjentów z CRC. Jednocześnie re-EG są częściej wykrywane w RTK u kobiet (60,5%) niż u mężczyzn (39,5%), ze zlokalizowanym stadium choroby (63,1%) i nowotworem w prawej części jelita grubego (59,4%).

Markery nowotworowe angiogenezy

Naukowcy wykazali duże zainteresowanie w ostatnich latach badaniem czynników angiogennych w guzie, w szczególności VEGF. Istnieje coraz więcej dowodów na to, że przerzuty na różnych etapach procesu nowotworowego zależą od stopnia unaczynienia guza.

W hematogennych przerzutach komórki nowotworowe muszą przylegać do komórek śródbłonka, przechodzić do światła naczynia, przeżywać we krwi krążącej, zatrzymywać się w określonym narządzie lub tkance i tworzyć tam kolonię. Wysoko angiogenne guzy pierwotne, w tym CRC, o dużej gęstości wewnątrznaczyniowej prawdopodobnie wytwarzają klon angiogenny w odległym narządzie, który w sprzyjających warunkach jest zdolny do tworzenia przerzutów. Większość badaczy uważa, że ​​wysoki stopień unaczynienia guza jest statystycznie znaczącym markerem obecności przerzutów w regionalnych węzłach chłonnych. W 77% wcześniejszych badań stwierdzono istotny związek między angiogenezą guza a rozwojem przerzutów odległych. I chociaż istnieją znaczące różnice w badanych grupach pacjentów i metody stosowane do oceny angiogenezy, większość badaczy wykazała odwrotną zależność między waskularyzacją guza a przeżyciem pacjentów z CRC. Ponadto niewystarczające unaczynienie, aw rezultacie jego niedotlenienie, zwiększają ekspresję genów związanych z opornością (glikoproteina Pg, reduktaza hydrofolianowa) na chemioterapię i stanowią ważną nieskuteczność napromieniania neoadiuwantowego i chemioterapii.

U większości pacjentów (73,4%) z regionalnymi przerzutami do węzłów chłonnych okres bez nawrotów był istotnie wyższy przy braku ekspresji VEGF i niskim wskaźniku SPF (frakcja S) w guzie. Oprócz znaczenia prognostycznego VEGF, wykazano, że blokowanie receptora VEGF-2 hamuje wzrost przerzutów CRC w wątrobie.

Obecnie ponad 200 związków wykazuje aktywność angiogenną, a wszystkie z nich można podzielić na dwie grupy w zależności od działania hamującego. Pierwsza grupa obejmuje związki, które wpływają na transfer sygnałów angiogennych przez komórki śródbłonka (antagoniści śródbłonkowych czynników wzrostu, inhibitory wytwarzania czynników angiogennych, migracja komórek śródbłonka), a drugie - związki, które wpływają na proliferację komórek śródbłonka. Najbardziej obiecujące leki antyangiogenne, takie jak marimastat, batimastat - inhibitory metaloproteinaz macierzy, SU 6661.

Należy zauważyć, że w ostatnich latach nasza wiedza na temat procesów biologicznych związanych z tworzeniem nowych mikronaczyń w guzie znacznie wzrosła. I chociaż wciąż istnieją zasady prognostyczne i terapeutyczne, postępy w zrozumieniu patofizjologicznych mechanizmów neoangiogenezy w nowotworach są już wprowadzane do praktyki klinicznej.

Poziom syntetazy tymidylanowej w guzie jest uważany za jeden z najskuteczniejszych markerów oporności na lek i rokowania CRC. Enzym jest niezbędny do syntezy DNA i katalizuje metylowanie monofosforanu dezoksyurydyny do monofosforanu deoksytymidyny jako kofaktora dla 5,10-metylenotetrahydrofolanu (5,10-CH2FH4). Wiadomo, że 5-fluorouracyl (5-FU), jeden z najpowszechniej stosowanych antymetabolitów w leczeniu nowotworów żołądkowo-jelitowych, po podaniu pacjentowi, tworzy postacie 5-fluoro-2'-deoksyurydyno-5'-monofosforanowe, które kowalencyjnie wiążą się z syntazą timidylanową, blokując w ten sposób Proces syntezy DNA w guzie. Badanie wskaźników ekspresji syntetazy tymidylanowej w guzach pacjentów z CRC umożliwiło uznanie go za niezależny czynnik prognostyczny w tej kategorii pacjentów. Jednocześnie 10-letnie wskaźniki przeżycia były istotnie niższe wśród pacjentów, u których wykryto ekspresję enzymu w guzie.

Opierając się na retrospektywnej analizie wieloczynnikowej i wysokim stopniu wiarygodności wyników, z definicji, w ekspresji syntazy tymidylanowej w nowotworach, marker ten może być stosowany w klinice jako niezależny czynnik predykcyjny dla wznowy miejscowej, odległych przerzutów, okresu bez nawrotów i ogólnego przeżycia pacjentów z RTK.

Najlepsza prognoza dotyczyła pacjentów z TRK z niską ekspresją syntetazy tymidylanowej w pierwotnym guzie. Jednocześnie naukowcy przekonująco wykazali, że żadne inne czynniki prognostyczne, w tym wiek, płeć, stopień zróżnicowania guza, ekspresja p53, nie mogą być uznane za niezależne markery rokowania, w szczególności nawrotu tej choroby.

Poziom ekspresji syntetazy tymidylanowej w przypadku uogólnionego lub nawracającego CRC może być markerem wrażliwości guza na 5-FU. Najczęściej najwyższe poziomy ekspresji enzymu stwierdzono w przerzutach CRC do jamy brzusznej (82%) w porównaniu z przerzutami guza w wątrobie (47%). Uważa się, że należy to wziąć pod uwagę, przewidując wrażliwość rozsianych form guza na 5-FU i indywidualnie zmieniając strategię chemioterapii u pacjentów.

Wykazano również, że ekspresja syntetazy tymidylanowej i fosforylazy tymidynowej w guzach nieleczonych pacjentów z CRC ma nie tylko wartość prognostyczną w wyborze chemioterapii 5-FU wraz z takimi markerami proliferacji jak p53 i Ki-67, ale także koreluje ze wskaźnikami przeżycia wolnego od choroby i ogólnego. W tym samym czasie aktywność tych dwóch enzymów badano metodą biochemiczną w świeżo zamrożonych próbkach guza, a ich ekspresję porównywano za pomocą metody immunohistochemicznej w skrawkach parafinowych wraz z p53 i Ki-67. Stwierdzono również istotną korelację między wskaźnikiem aktywności enzymatycznej fosforylazy tymidynowej a aktywnością wiązania 5-fluoro-2'-deoksysyrydyno-5'-monofosforanu (metabolitu 5-FU). Okazało się, że aktywność syntetazy tymidylanowej i fosforylazy tymidynowej jest ściśle związana z procesami angiogenezy i proliferacji w CRC. Jednocześnie ekspresja VEGF istotnie korelowała z aktywnością fosforylazy tymidyny i indeksem Ki-67 w guzie, a także czasem trwania okresu bez nawrotu.

Podczas badania dehydrogenazy dihydropirymidynowej, pierwszego enzymu, który metabolizuje 5-FU do 5-fluorodihydrouracyl, stwierdzono, że wskaźnik ekspresji tego enzymu w guzie może być stosowany jako marker w ocenie wrażliwości CRC na 5-FU.

Wysoka aktywność indukowanej syntetazy tlenku azotu może służyć jako marker bardziej agresywnego przepływu CRC.

Proponuje się zastosowanie wysoce czułej i specyficznej metody oznaczania aktywności telomerazy w nabłonku

Komórki CRC krążą we krwi. Aktywność enzymu wykryto w 72% nowotworów w stadiach C i D (klasyfikacja Dukesa) CRC. Uważa się, że ten marker w tej minimalnie inwazyjnej metodzie może być stosowany we wczesnej diagnostyce, prognozowaniu i monitorowaniu pacjentów z TCR.

Stwierdzono, że zwiększona ekspresja fosfatazy CDC25B w komórkach CRC w 43% przypadków wskazuje na złe rokowanie choroby. Dlatego pacjenci ci potrzebują terapii uzupełniającej. Uważa się, że CDC25B może służyć jako niezależny marker prognostyczny, a nawet czynniki kontrolne, takie jak przerzuty w regionalnych węzłach chłonnych, średnica guza pierwotnego, stopień jego zróżnicowania i głębokość inwazji. Co więcej, poziom ekspresji CDC25B silnie wskazuje na możliwy wczesny nawrót CRC etapów B i C według Dukesa.

Ostatnio pojawiły się badania wskazujące na możliwość wykorzystania enzymu do syntezy prostaglandyn i eikozanoidów - cyklooksygenazy-2 (COX-2), znanej również jako syntetaza endoperoksydowa prostaglandyny - jako markera wczesnej diagnozy i prognozy CRC. Dane eksperymentalne i kliniczne wskazują na ważną rolę COX-2 w patogenezie CRC. Pokazano brak COX-2 w nabłonku normalnej błony śluzowej i ekspresji białka w 40% polipów i 80-90% nowotworów złośliwych okrężnicy, co potwierdza udział COX-2 w procesach nowotworowych i progresji CRC. Ustalono dodatnią korelację między ekspresją COX-2 a wielkością, stadium guza zgodnie z klasyfikacją Dukesa. Zwiększona ekspresja COX-2 w RTC stała się podstawą prób wykorzystania jej inhibitorów, w szczególności niesteroidowych leków przeciwzapalnych, jako środków profilaktycznych, które zapobiegają rozwojowi CRC i złośliwości polipów jelita grubego. W doświadczeniach na zwierzętach wykazano, że inhibitory COX-2 wywierają ochronny wpływ na rakotwórczość jelita grubego. Ponadto leki te zapobiegły powstawaniu nowych polipów i przyczyniły się do regresji już istniejących polipów w okrężnicy. Z drugiej strony, dane z niektórych badań eksperymentalnych sugerują, że działanie przeciwnowotworowe niesteroidowych leków przeciwzapalnych jest również spowodowane faktem, że indukują apoptozę w komórkach PTK i hamują angiogenezę w nowotworach doświadczalnych.

Inne markery CRC

W skrócie, skupimy się na niektórych markerach nowotworów, których zastosowanie wydaje się obiecujące dla CRC.

Poziom ekspresji MUC1 w nowotworach może być stosowany jako marker w ocenie postępu i rokowania CRC.

Zależny od cyklin inhibitor kinazy P27 (KIP1) można stosować jako marker do wykrywania wczesnych stadiów CRC. Nie można go jednak użyć jako markera wczesnego postępu tych nowotworów.

Ostatnio zaproponowano zastosowanie nowego markera, TA90-IC, który jest obecny w surowicy w postaci krążących kompleksów immunologicznych, przy szacowaniu występowania RTK. Podstawą badania był fakt, że według wielu autorów poziom CEA był podwyższony tylko u 70% pacjentów w powszechnym stadium choroby. Przerzuty odległe ujawniono u 86% badanych pacjentów, chociaż wielu z tych pacjentów miało klinicznie zlokalizowany guz bez oznak uogólnienia procesu nowotworowego. Analiza poziomu powyższych markerów wykazała, że ​​stężenie TA90-IC wzrosło w 82,9%, a CEA - tylko u 70,2% pacjentów. Połączenie obu markerów pozwoliło nam ustalić częstość występowania procesu nowotworowego w 93,5% przypadków. Naukowcy uważają, że prace te należy kontynuować i udowodnić rolę TA90-IC w badaniach przesiewowych i monitorowaniu postępu CRC.

Należy zauważyć, że najbardziej odpowiedni z klinicznego punktu widzenia może być równoczesne oznaczenie tylko niewielkiej liczby uzupełniających wskaźników, które mogą charakteryzować aktywność proliferacyjną CRC, jego potencjał przerzutowy, wrażliwość na różne rodzaje regulacji centralnych i lokalnych. Zadaniem naukowców pracujących w tej dziedzinie jest wybór optymalnej ilościowo i jakościowo kombinacji markerów molekularnych w diagnostyce, monitorowaniu i prognozowaniu CRC.

4.4.3. Choroby nowotworowe trzustki, żołądka, przełyku i wątroby

W Europie Zachodniej rak trzustki jest wykrywany w około 10 przypadkach na 100 tys., Około 90% wszystkich nowotworów.

chorobami trzustki są gruczolakoraki przewodów, a tylko 5% stanowią nowotwory neuroendokrynne i rak zrazikowy.

Najszerzej stosowanym markerem w diagnostyce raka trzustki jest CA 19-9. Specyfika jego oznaczania waha się od 76 do 99%, a czułość - od 69 do 93%. Jednak zwiększone stężenie CA 19-9 w surowicy nie jest specyficzne tylko dla gruczolakoraków trzustki. Wysoki poziom CA 19-9 stwierdzono w innych chorobach przewodu pokarmowego (ostre i przewlekłe zapalenie trzustki, marskość wątroby, zapalenie dróg żółciowych).

Wykazano, że tylko 55% pacjentów z rakiem trzustki o średnicy guza mniejszej niż 3 cm ma zwiększony poziom CA 19-9 (> 37 U / ml). W konsekwencji stosowanie markera CA 19-9 w diagnostyce raka trzustki, w szczególności jego wczesnych postaci, jest ograniczone, ponieważ jego poziom wzrasta nawet w przypadku wspomnianych powyżej łagodnych procesów w wątrobie i trzustce. Zaleca się określenie wskaźników CA 19-9 w celu oszacowania prognozy raka trzustki, ale nie w rutynowej praktyce.

W badaniach perspektywicznych badano również szereg innych markerów raka trzustki: CA50, CA242, CA195, DU-PAN 2 mucins, CAM 17.1 / WGA. Jednak obecnie CA 19-9 należy uznać za „złoty standard” w diagnostyce raka trzustki.

Rak żołądka jest jedną z najczęstszych postaci nowotworów na świecie. W Europie Zachodniej jej częstotliwość spadła w ciągu ostatniej dekady, podczas gdy w Azji wskaźnik umieralności wzrósł i wynosi około 100 na 100 tys. W USA 6 pacjentów na 100 tys.

Trzy markery są badane wystarczająco szczegółowo dla raka żołądka: CEA, CA 19-9 i CA 72-4, ale CA 72-4 jest uważany za najbardziej czuły i specyficzny. CEA i CA 19-9 mają tę samą specyficzność, chociaż CA 19-9 może być bardziej wrażliwy niż CEA, jednak żaden z powyższych markerów nie może być stosowany w badaniach przesiewowych i wczesnym diagnozowaniu raka żołądka.

Częstość występowania raka przełyku jest bardzo zróżnicowana. Tak więc w Azji Środkowej częstość ich występowania wynosi 50-100 przypadków na 100 000, podczas gdy w Europie i USA - 2-3 przypadki na 100 000. W 90% raka przełyku reprezentuje rak płaskonabłonkowy i mniej niż 10% gruczolakorak.

W porównaniu z innymi nowotworami przewodu pokarmowego, biochemiczne markery raka przełyku nie zostały wystarczająco zbadane. Uważa się jednak, że SCC i cytokeratyny (CYFRA 21-1, TPA, TPS) należy uznać za najlepsze markery w diagnostyce raka przełyku z nabłonka płaskonabłonkowego, podczas gdy CA 19-9 jest preferowany w diagnostyce gruczolakoraków przełyku. Jednak markery nowotworowe w diagnostyce guzów przełyku nie były przedmiotem szczególnej uwagi ze względu na ich niespecyficzność.

Inną nazwą tej choroby jest „złośliwy wątrobiak”. Taka diagnoza występuje w Europie Zachodniej z częstotliwością 5-10 przypadków na 100 tysięcy, aw Europie Południowej mniej niż 5 przypadków na 100 tysięcy. Rak wątroby jest najczęściej wykrywany w Chinach, gdzie zalecane jest badanie przesiewowe endemicznego ogniska tego nowotworu w celu wykrycia guzów.

Głównym markerem w diagnostyce raka wątrobowokomórkowego jest α-fetoproteina, która po badaniu przesiewowym wykazuje guzy o niewielkich rozmiarach, co przyczynia się do zwiększenia przeżywalności pooperacyjnej w tej kategorii pacjentów. Należy jednak zauważyć, że rola α-FP w badaniach przesiewowych w kierunku gruczolakoraka wątroby nie została określona w prospektywnych badaniach randomizowanych. Biorąc pod uwagę bardzo rzadkie wykrywanie tych nowotworów w Europie Zachodniej, uważa się, że badania przesiewowe raka wątrobowokomórkowego nie są wymagane. Jednak od 1986 r. Zalecano ultrasonografię wątroby co 6 miesięcy i oznaczanie co 3 miesiące stężenia α-AF u pacjentów pozytywnych na antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, a także pacjentów cierpiących na przewlekłe aktywne zapalenie wątroby lub marskość wątroby. Uważa się również, że pacjenci z uporczywym zakażeniem, w szczególności pacjenci z wirusowym zapaleniem wątroby typu C, również powinni być uważani za zagrożonych gruczolakorakiem wątroby. Udowodniono, że ryzyko rozwoju tego nowotworu w wirusowym zapaleniu wątroby typu C i marskości wątroby jest 100 razy większe niż u osób niezakażonych.

Jednym z ważnych problemów związanych ze stosowaniem α-FP w diagnostyce różnicowej gruczolakoraka wątrobowokomórkowego jest zapalenie wątroby i marskość wątroby, w których wzrasta również poziom markera nowotworowego. Dlatego rozdział fukozylowanego α-OP od normalnego α-OP przez wiązanie z lektynami pomaga w diagnostyce różnicowej powyższych chorób. Identyfikacja tych frakcji α-OP pomaga w diagnostyce różnicowej raka wątrobowokomórkowego. Ponadto, w przypadku łagodnych chorób, poziom α-FP może chwilowo wzrastać, podczas gdy w przypadku raka wątrobowokomórkowego jest on stale podwyższony w surowicy krwi. Dlatego oznaczanie α-OP kilka razy w ciągu 2–3 tygodni pozwala wykluczyć jego fałszywie dodatnie wartości. Ponadto niedawno pojawił się nowy marker w diagnostyce gruczolakoraka wątrobowokomórkowego - protrombiny des-gamma-carboy (DCP), znanej również jako PIVKA II (białko indukowane przez brak witaminy K). Kombinacja tego markera z α-FP pozwala na identyfikację raka wątrobowokomórkowego u 86% i pojedynczego guza u 78,3%, aw tych przypadkach jeden z tych markerów będzie dodatni.

4.4.4. NIEDOZWOLONE KOBIETY SYSTEM ROZRODCZY

Nowotwory narządów płciowych u kobiet stanowią 15% wszystkich guzów i są rozłożone zgodnie z szybkością ich rozpadu w następującej kolejności: rak ciała macicy, jajników i szyjki macicy. Jednak w strukturze śmiertelności rak jajnika zajmuje pierwsze miejsce, a następnie rak szyjki macicy i macicy. Na przykład w USA corocznie rejestruje się 20 tysięcy nowych przypadków raka jajnika i 12 tysięcy zgonów z tego nowotworu. Etiologia choroby jest nieznana, jednak brak owulacji, stosowanie pewnych środków antykoncepcyjnych, a także podatność rodzinna są czynnikami ryzyka.

Ponad 90% guzów jajnika ma charakter nabłonkowy, tj. powstają z nabłonka koelomicznego. Nabłonkowe guzy jajnika są klasyfikowane na podstawie typu komórek: surowiczego, śluzowego, endometrioidalnego, jasnokomórkowego, mieszanego nabłonkowego, niezróżnicowanego, płaskonabłonkowego. Najczęściej rak jajnika rozwija się z komórek surowiczych.

Najlepszym markerem dla nabłonkowego raka jajnika jest mucyna - CA 125. Podczas miesiączki poziom markera u kobiet może wzrosnąć do 100 kU / l i więcej. Poziom CA 125 wzrasta u prawie 80% pacjentów z nabłonkowymi guzami jajnika, jednak tylko połowa pacjentów z rakiem jajnika w stadium I według międzynarodowej klasyfikacji (FIGO) tej choroby wykazuje wysoki wskaźnik markera nowotworowego. Niewystarczająca czułość we wczesnej diagnostyce, jak również wykrywanie podwyższonych wartości CA 125 w różnych łagodnych nowotworach i innych gruczolakorakach, nie pozwalają na zastosowanie tego wskaźnika jako markera do wczesnego wykrywania raka jajnika. Wraz z poziomem innych markerów (α-OP, hCG, hCGb) poziom CA 125 może wzrastać wraz z nowotworami z komórek zarodkowych.

Rokowanie raka jajnika zależy głównie od stadium choroby. Badanie przesiewowe CA 125 jest niewrażliwe i tylko 50% pacjentów w stadium I choroby ma podwyższony poziom markera, dlatego ten marker nie jest zalecany do wykrywania sporadycznych przypadków choroby. Jednak oznaczenie CA 125 w połączeniu z ręcznym badaniem odbytniczo-pochwowym narządów miednicy i ultrasonografią przezpochwową może być ważne we wczesnym wykrywaniu raka jajnika.

Wieloośrodkowe, prospektywne badanie kobiet po menopauzie z guzami w miednicy małej oraz porównanie przezpochwowej ultrasonografii, badania manualnego narządów miednicy i oznaczenia CA 125 (próg CA 125 35 kU / l) wykazało, że rozpoznanie zostało potwierdzone tymi metodami odpowiednio na 77, 76 i 74%. Ponadto, stosując analizę regresji, wykazano, że w porównaniu z ultrasonografią CA 125 jest bardziej czuły, ale wartość diagnostyczna jest gorsza niż w przypadku badania manualnego. Guzy nie są wykrywane z kombinacją negatywnych wyników trzech metod. Określenie poziomu CA 125 przed zabiegiem może skłonić lekarza do uzyskania możliwych korzyści chirurgicznych.

Wiadomo, że tradycyjnymi czynnikami prognostycznymi u pacjentów z rakiem jajnika są stadium choroby, stopień zróżnicowania i typ histologiczny guza, wielkość resztkowego guza po operacjach cytoredukcyjnych paliatywnych. Jednocześnie wieloośrodkowe badania wykazały, że poziom CA 125 w surowicy pacjentów po 1., 2. i 3. cyklu chemioterapii jest jednym z najważniejszych czynników prognostycznych wczesnego

on nawrót choroby. Wydłużony okres półtrwania CA wynoszący 125 lub mniej niż 7-krotny spadek poziomów markerów nowotworowych w pierwszych miesiącach po leczeniu wskazuje na zły wynik. Dalsze badania wykazały, że stężenie CA 125> 70 kU / l przed trzecim kursem chemioterapii jest najważniejszym czynnikiem w przewidywaniu postępu choroby w ciągu najbliższych 12 miesięcy.

CA 125 podczas monitorowania pacjentów z rakiem jajnika pozwala na wykrycie wczesnego nawrotu. W literaturze nie ma jednak danych wskazujących, że wczesne wykrycie nawrotu choroby może poprawić wskaźniki przeżycia. Wzrost CA 125 wskazuje na chorobę rezydualną w 94,8% przypadków, jednak prawie połowa pacjentów z prawidłowymi wartościami markerów również miała chorobę (węzły guza) zgodnie z „drugim spojrzeniem” - konaromotomią. Poziomy CA 125 są zwiększone w surowicy 25% pacjentów, którzy mają tylko mikroskopowe objawy choroby iu 79% pacjentów, których średnica guza nawrotowego jest większa niż 1 cm podczas laparotomii.

Rak piersi

Rak piersi (BC) jest jedną z głównych przyczyn śmierci kobiet w krajach Europy Zachodniej, a podczas życia kobiety ryzyko tego nowotworu wynosi 12,2%, a ryzyko zgonu z tego powodu wynosi 3,6%. Istnieje wiele czynników związanych z ryzykiem raka piersi: czynniki genetyczne i rodzinne, czynniki hormonalne (wczesna miesiączka, późna menopauza, późna pierwsza ciąża), dieta, łagodne choroby piersi (związane głównie z przerostem atypowym).

Obecnie znanych jest wiele markerów nowotworowych dla raka piersi: MIS-1 (CA 15-3), CEA, onkoproteiny, cytokeratyny. Najczęściej stosowane są CEA i CA 15-3. Istnieją również inni członkowie rodziny genów MIS-1: MSA, CA 519, BR27-29, BRMA. Wszystkie mają tę samą czułość i specyficzność, jak również SA 15-3. Dlatego użycie kilku markerów nie powoduje natychmiastowego dodania informacji uzyskanych przy użyciu CA 15-3. Szereg markerów, takich jak cytokeratyny (TPA, TPS, CYFRA 21-1) i rozpuszczalne onkoproteiny (c-erbB-2), jest obecnie intensywnie badanych i przechodzi ocenę kliniczną.

Wrażliwość markerów nowotworowych u pacjentów z wczesnym rakiem piersi jest bardzo niska (15–35%), więc ich zastosowanie w diagnostyce

często trudne. Oczywiście wynikające z tego niskie wartości markerów nie wykluczają obecności ognisk pierwotnych i przerzutowych. Z drugiej strony, wysoki poziom markera u pacjentów z rakiem piersi prawie całkowicie wskazuje na obecność uogólnienia guza i pojedynczych przerzutów.

Wysokie poziomy CEA, CA 15-3 i innych markerów z rodziny MIS-1 są wyraźnie związane ze stadium raka piersi, wielkości guza i udziałem regionalnych węzłów chłonnych w procesie nowotworowym. Jednak nie jest jeszcze jasne, czy markery te są niezależnymi czynnikami prognostycznymi. Co więcej, nie wiadomo, czy zastosowanie takiego markera nowotworowego jako wskaźnika wczesnego nawrotu choroby doprowadzi do wzrostu przeżycia bez nawrotów i ogólnego przeżycia pacjenta.

W przypadku radykalnego leczenia raka sutka we wczesnej diagnozie nawrotu można również wykazać szeregowe oznaczenia CEA i CA 15-3. Te markery nowotworowe w ciągu 2-18 miesięcy (średnio 5,2 miesiąca) występują u 40-60% pacjentów z nawracającym rakiem piersi przed pozytywną odpowiedzią zgodnie z wynikami badań klinicznych, instrumentalnych i radiologicznych (prześwietlenie klatki piersiowej, ultrasonografia wątroby, skanowanie szkieletu). Dynamiczne oznaczanie poziomów CEA i CA 15-3 jest uważane za dość czuły test we wczesnej diagnostyce przerzutów do kości i wątroby, a ponadto zmniejsza częstość pacjentów ze skanowaniem izotopowym i radioizotopowym.

Markery tkankowe w raku piersi

W przeciwieństwie do klasycznych markerów nowotworowych, oznaczanych w surowicy, markery komórkowe lub tkankowe są typowane bezpośrednio w tkance guza. Większość z nich charakteryzuje pewne cechy biologiczne guza, specyfikę jego zachowania i regulacji, na przykład wrażliwość hormonalną lub tendencję do inwazji i przerzutów. Dla niektórych markerów molekularnych nie ustalono jeszcze określonej funkcji biologicznej. Główne znaczenie takich markerów polega na tym, że charakteryzują one cechy biologiczne każdego konkretnego guza i pomagają w przewidywaniu i indywidualizacji leczenia farmakologicznego choroby.

W zakładce. 4.10 przedstawia znaczące biologicznie wskaźniki, które są aktywnymi lub potencjalnymi markerami tkankowymi raka piersi.

Tabela 4.10. Główne grupy tkankowych / komórkowych markerów prognostycznych raka piersi

W ogólnym przypadku definicja markera molekularnego w raku piersi może mieć trzy praktyczne wyniki: 1) identyfikacja wśród pacjentów we wczesnych stadiach grup ryzyka raka wymagających dodatkowego leczenia, jak również tych, którzy nie są poddawani terapii uzupełniającej; 2) określenie wrażliwości na niektóre rodzaje terapii i indywidualizację schematów leczenia uzupełniającego pacjentów wspólnym procesem; 3) rozwój nowych leków.

Receptory hormonów steroidowych, głównie receptory estrogenowe (ER), były jednymi z pierwszych wskaźników uwzględnionych w praktyce leczenia wskaźników raka piersi związanych z kategorią markerów komórkowych. Nieco później, oprócz nich, zidentyfikowano również receptory progesteronu (RP).

Obecność ER w pierwotnym guzie piersi wskazuje na jego potencjalną wrażliwość na środki terapeutyczne mające na celu usunięcie źródła estrogenów z organizmu lub przeciwdziałanie ich skutkom (wycięcie jajników, stosowanie antyestrogenów).

RP jest przedmiotem zainteresowania jako marker molekularny raka piersi, nie tylko dlatego, że jest pierwszym elementem odpowiedzi komórki na progestyny, określającym wrażliwość na odpowiednie leki, ale także dlatego, że jego synteza w komórkach raka piersi jest indukowana przez estrogeny. Zatem obecność RP może wskazywać na funkcjonalną aktywność ER.

Obecnie różne kliniki i laboratoria stosują trzy stosunkowo równoważne metody określania statusu receptora raka piersi: radioligand - ocena zdolności wiązania receptora w cytozolu nowotworów; test immunoenzymatyczny - oznaczanie stężenia immunoreaktywnego białka receptorowego w tych samych cytozolach; immunohistochemiczne - specyficzne barwienie skrawków guza przy użyciu przeciwciał przeciwko białkom receptorowym. Zaletą pierwszych dwóch metod jest ilościowa, pozwalająca na obiektywizację kryteriów oceny statusu receptora. Metoda radioligandu umożliwia również ocenę funkcjonalnej aktywności receptora na jednym z pierwszych etapów jego interakcji z hormonem, co sprawia, że ​​przewidywanie czułości hormonalnej jest bardziej wiarygodne niż przy określaniu białek immunoreaktywnych.

Z drugiej strony, chociaż metoda immunohistochemiczna ma charakter półilościowy, ma ważną zaletę, a mianowicie, że barwiąc sekcje można wyraźnie

określić przynależność receptorów do komórek nowotworowych. W przypadku stosowania metod biochemicznych taka możliwość jest nieobecna. Ponadto metoda ta pozwala na pracę z materiałem archiwalnym - bloczkami parafinowymi, a nawet gotowymi szkłami, co sprawia, że ​​jest to jedyna możliwa opcja, gdy potrzeba badań nad receptorami hormonów steroidowych pojawiła się lub została zrealizowana długo po operacji.

Wiadomo, że zależny od hormonów wariant raka piersi, gdy typowany jest oba lub co najmniej jeden z receptorów hormonów steroidowych, charakteryzuje się korzystnym przebiegiem, a okres pooperacyjny u tych pacjentów jest lepszy niż w przypadku guzów receptorowo-negatywnych. Niemniej jednak, w praktycznej pracy klinicznej, wyniki określania receptorów hormonów steroidowych są stosowane głównie w selekcji pacjentów wrażliwych na leczenie hormonalne.

Receptory czynników wzrostu. Ta grupa obejmuje również same czynniki wzrostu - białka i małe polipeptydy wytwarzane przez same komórki nowotworowe i inne składniki tkanki nowotworowej (fibroblasty, makrofagi i limfocyty naciekające nowotwór, komórki śródbłonka) i stymulujące wzrost komórek produkcyjnych (mechanizm autokrynny) lub komórek sąsiednich (parakryna mechanizm).

W autokrynną i parakrynną regulację proliferacji komórek raka piersi biorą udział różne czynniki wzrostu: peptydy grupy EGF (czynnik wzrostu transformujący α, amfiregulina itp.), Które oddziałują ze wspólnym receptorem, insulinopodobne czynniki wzrostu (IGF), somatostatyna itp. Receptory tych czynników wzrostu były znaleziono w guzach u pacjentów z rakiem piersi. Obecność w guzie gruczołu sutkowego EGFR, zwłaszcza przy braku receptorów hormonów steroidowych, wskazuje na niekorzystne rokowanie choroby nawet we wczesnych stadiach i oporności na leczenie hormonalne. Istnieją dowody na to, że obecność receptorów IGF i receptorów somatostatyny wskazuje na korzystniejsze rokowanie raka piersi.

Niemniej jednak, z powodu niejednoznaczności wyników uzyskanych przez różnych autorów, żaden ze wskaźników charakteryzujących wrażliwość raka piersi na regulatory auto i parakryny nie wszedł jeszcze do rutynowej praktyki klinicznej, takiej jak badanie poziomu receptorów hormonów steroidowych. Można się jednak spodziewać, że w najbliższym czasie zainteresowanie badaniem EGFR w raku piersi ponownie wzrośnie, ze względu na fakt, że już na etapie klinicznym

próby, leki specyficznie działające na EGFR, przeciwciała monoklonalne wobec receptora i inhibitory wewnętrznej kinazy tyrozynowej EGFR, wdrażające pierwszy etap mitogennej transmisji sygnału, zostały uwolnione.

Należy zauważyć, że do tej pory „złoty standard” w badaniu dyfrakcji rentgenowskiej uważa się za oznaczanie radioligandu we frakcji błonowej tkanek przy użyciu EGF znakowanego 125 I i następnie rozdzielanie hydroksyloapatytu.

Pewien sukces w dziedzinie praktycznego stosowania markerów związanych z regulacją wzrostu raka piersi zależnego od REFR osiągnięto już po pojawieniu się leku Herceptin, który jest humanizowanym przeciwciałem przeciwko HER2 / neu, jednemu z receptorów z rodziny ErbB, do którego należy REFR.

Rodzina receptorów kinazy tyrozynowej - produkty grupy onkogenów c-erbB, która obejmuje cztery receptory transbłonowe o podobnej strukturze, REFR (ErbB-1), ErbB-2 (HER2 / neu), ErbB-3 (HER3) i ErbB-4 (HER4) ) jest jednym z najważniejszych systemów regulacyjnych dla mitogennej transmisji sygnału.

Oprócz struktury, rodzina receptorów ErbB różni się względną specyficznością i powinowactwem do różnych typowych ligandów. Główną cechą wszystkich receptorowych kinaz tyrozynowych jest lokalizacja przezbłonowa i konieczność interakcji z odpowiednim ligandem (czynnikiem aktywującym) dla realizacji aktywności kinazy i kolejnych efektów biologicznych. Po aktywacji w wyniku wiązania i dimeryzacji liganda, wewnętrzna receptorowa kinaza tyrozynowa jest aktywowana i uzyskuje zdolność do fosforylacji zarówno samego receptora, jak i innych białek komórkowych zaangażowanych w przekazywanie sygnału mitogennego. Receptory rodziny ErbB mogą tworzyć zarówno homo jak i heterodimery, aw wielu przypadkach najbardziej aktywne są heterostruktury z udziałem receptora HER2 / neu, który nie ma własnego liganda.

Zatem HER2 / neu jest unikalnym przedstawicielem rozważanej rodziny transbłonowych kinaz tyrozynowych, ponieważ bez własnego ligandu i bez interakcji ze znanymi czynnikami wzrostu, które aktywują pokrewne receptory, jest to jednak kluczowy element w przekazywaniu sygnałów mitogennych wszystkich EGF- podobne peptydy i jest niezbędne do skutecznego funkcjonowania całego systemu.

Jeśli chodzi o wartość prognostyczną nadekspresji lub amplifikacji genu c-erbB-2, pomimo gigantycznego materiału (ponad 12 000 pacjentów z rakiem piersi zostało zbadanych w różnych laboratoriach na całym świecie), nie ma zgody co do wartości predykcyjnej HER2 / neu. Niektórzy autorzy zauważyli jego niekorzystny wpływ na przeżycie bez nawrotów pacjentów z rakiem piersi bez przerzutów do węzłów chłonnych, inni badacze nie znajdują wiarygodnego związku między tymi wskaźnikami. Opublikowane dane wskazują, że guzy ze wzmocnionym genem HER2 / neu nie reagują dobrze na terapię hormonalną, ale są wrażliwe na późniejszą chemioterapię. Obecnie uważa się również, że pacjentom z guzami HER2 / neu-dodatnimi należy zalecić bardziej intensywne schematy chemioterapii niż pacjenci z guzami, u których nie ma zwiększonej ekspresji tego onkogenu.

System aktywacji plazminogenu. Zdolność do przerzutów i inwazji jest jedną z podstawowych właściwości nowotworów złośliwych, której najważniejszym mechanizmem jest zniszczenie otaczającej błony podstawnej i macierzy zewnątrzkomórkowej przez proteazy związane z nowotworem. Te proteazy są również zaangażowane w neoangiogenezę, przyczyniając się do proliferacji nowych naczyń krwionośnych w guzie.

Kaskada proteolityczna aktywacji plazminy w tkance guza zajmuje centralne miejsce. Uważa się, że plazmina, która jest w stanie obniżyć poziom glikoprotein macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywować niektóre proteazy prometalowe, takie jak kolagenaza typu IV, odgrywa kluczową rolę zarówno w lokalnym rozprzestrzenianiu się nowotworu, jak iw tworzeniu przerzutów w odległych narządach i tkankach. W wieloetapowym łańcuchu proteaz prowadzącym do zniszczenia macierzy zewnątrzkomórkowej kluczową pozycję zajmuje aktywator plazminogenu typu urokinazy (uPA). Ważną rolę odgrywa również receptor uPA znajdujący się na powierzchni komórki, ponieważ zdolność uPA do aktywacji plazminogenu wzrasta, gdy się z nim wiąże. Ogólnie proces tworzenia plazminy jest cykliczną amplifikacją regulowaną przez mechanizm sprzężenia zwrotnego.

Oprócz uPA, aktywator typu tkankowego (tPA) jest również zaangażowany w aktywację plazminogenu, ale jego rola w rozwoju nowotworów wydaje się być odwrotna i zmniejsza się do zniszczenia komórek nowotworowych.

komórki i ochrona otaczających tkanek. Aktywność IRA i tPA jest hamowana przez dwa inhibitory białek należących do rodziny serpin, PAI-1 i PAI-2. Na podstawie danych doświadczalnych i klinicznych, podczas wzrostu guza, dwa inhibitory aktywatorów plazminogenu odgrywają również inną rolę: PAI-1 chroni komórki nowotworowe przed samozniszczeniem, a PAI-2 hamuje procesy proteolityczne w macierzy zewnątrzkomórkowej.

Różne składniki systemu aktywacji plazminogenu w tkance piersi mogą być zlokalizowane zarówno na samych komórkach nowotworowych, jak i na fibroblastach zrębu, limfocytach i makrofagach oraz komórkach śródbłonka naciekających guz. W związku z tym możemy założyć, że proces aktywacji plazminogenu jest przede wszystkim parakrynny.

Poziom i stosunek ekspresji składników systemu aktywacji plazminogenu w tkance nowotworowej może służyć jako wskaźnik przerzutowej i inwazyjnej aktywności guza, w wyniku czego biologicznie istotny czynnik prognostyczny dla nowotworów złośliwych lub wskaźnik ryzyka złośliwości w łagodnych nowotworach. Ponadto, tłumienie aktywacji plazminogenu przez typ urokinazy na różnych poziomach może stać się jednym z podejść do opracowania nowych rodzajów terapii przeciwprzerzutowej, dla których konieczne jest zastosowanie kliniczne w celu zidentyfikowania grup pacjentów potencjalnie wrażliwych na takie leczenie. Rozwój takich leków jest już dość aktywnie przeprowadzany w laboratoriach eksperymentalnych i firmach farmaceutycznych, co sprawia, że ​​badanie ich docelowych białek w ludzkich guzach jest szczególnie istotne.

Najbardziej odpowiednią metodą oceny poziomu ekspresji składników systemu aktywacji plazminogenu jest obecnie ilościowy test immunoenzymatyczny do określania ich stężenia w cytozolach tkanek. Niestety, nie ustalono jeszcze jednolitych progów, chociaż międzynarodowe badania kooperacyjne są już prowadzone w tym kierunku.

Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego. W ostatnich latach wiele uwagi poświęcono problemowi neoangiogenezy - tworzeniu nowych naczyń krwionośnych - w nowotworach złośliwych. W przeciwieństwie do waskulogenezy, angiogeneza jest procesem rozgałęziania nowych procesów kapilarnych z istniejących naczyń krwionośnych. Fakt, że guz nie może się rozwijać i rozwijać bez tworzenia się

ma rozległą sieć naczyń włosowatych, które dostarczają komórkom tlenu i składników odżywczych. Badanie molekularnych mechanizmów angiogenezy umożliwiło przejście od oceny mikroskopowej gęstości naczyń krwionośnych w tkance nowotworowej do badania określonych cząsteczek zaangażowanych w regulację powstawania i wzrostu nowych naczyń krwionośnych. Najważniejszym pozytywnym regulatorem angiogenezy jest niewątpliwie VEGF, zwany także czynnikiem przepuszczalności naczyń. Wyjątkowość tego czynnika polega na tym, że w przeciwieństwie do wszystkich innych czynników wzrostu, jest mitogenny tylko w stosunku do komórek śródbłonka. Udowodniono, że VEGF odgrywa kluczową rolę w neoangiogenezie w raku piersi.

Wyniki szeregu retrospektywnych badań klinicznych opublikowanych niedawno pokazują, że ekspresja VEGF w raku piersi wydaje się być istotna dla prognozowania choroby, a także wpływa na wrażliwość guzów na leczenie hormonalne i lekowe. Wysoki poziom Ero wskazuje na złe rokowanie zarówno dla wczesnego, jak i wspólnego raka piersi. Ponadto nowe leki o właściwościach antyangiogennych są aktywnie rozwijane i badane, a ocena aktywności angiogenezy zależnej od VEGF może być podstawą ich ukierunkowanego stosowania.

Rak szyjki macicy

Prawie na całym świecie rak szyjki macicy po raku piersi jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu chorób nowotworowych. Głównymi czynnikami ryzyka tej choroby są: społeczno-ekonomiczne, wczesne małżeństwo, duża liczba partnerów seksualnych, a także zakażenia wywołane wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) (typy 16, 18, 31 i 45). Wskaźniki 5-letniego przeżycia dla tej choroby wynoszą około 70%. Jeśli jednak nowotwór zostanie wykryty we wczesnym stadium, 5-letni wskaźnik przeżycia wzrośnie do 90%. Należy zauważyć, że 90% nowotworów szyjki macicy to rak płaskonabłonkowy, a innych typów histologicznych - gruczolakorak i rak płaskonabłonkowy. Mięsaki lub rak neuroendokrynny występują bardzo rzadko.

W diagnostyce raka płaskonabłonkowego szyjki macicy stosuje się jako marker nowotworowy antygen SCCA - białko (masa cząsteczkowa 48 kD) o silnej homologii z rodziny inhibitorów proteaz, tak zwanych serpinów. Czułość metody w stadium I choroby jest mniejsza niż 30%, aw stadium IV - 90%. Jednak

Ekspresja SCCA może również wzrastać w innych guzach płaskonabłonkowych (rak płuc, guzy głowy i szyi, nowotwory przełyku i pochwy), łagodne guzy skóry (łuszczyca, egzema), płuca (sarkoidoza), wątroba i nerki. Ten marker nowotworowy nie jest używany w badaniach przesiewowych.

W badaniach przesiewowych w kierunku raka szyjki macicy na całym świecie zaproponowano program Papanicolau, instrumentalne i morfologiczne metody diagnostyczne, które diagnozują guzy przedinwazyjne, takie jak rak in situ (CIS) i śródnabłonkowa neoplazja szyjki macicy (CIN). Rozwój tych procesów w ciągu 10-15 lat może poprzedzać raka szyjki macicy. W diagnostyce wczesnych stadiów nie stosuje się SCCA, ponieważ poziom markera nowotworowego zależy od objętości guza pierwotnego, stadium i zajęcia węzłów chłonnych w procesie nowotworowym. Podwyższony poziom SSCA przed leczeniem może być niezależnym czynnikiem w ocenie zmian przerzutowych regionalnych węzłów chłonnych.

Wysokie wartości markera przed leczeniem wskazują na złe rokowanie u pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym szyjki macicy. Niektóre badania wykazały, że SCCA może być stosowany jako niezależny czynnik prognostyczny w raku szyjki macicy. W gruczolakorakach szyjki macicy CA 125 jest bardziej przydatny jako czynnik prognostyczny, ale nie SCCA.

Znacznik SCCA określa się do wykrywania wczesnego nawrotu raka płaskonabłonkowego szyjki macicy, a także monitorowania przed terapią neoadiuwantową i przed nawrotową terapią nowotworu. W tych przypadkach korelacja wynosi 80%, co ma istotne znaczenie kliniczne przy wyborze pacjentów do późniejszej radioterapii lub leczenia chirurgicznego.

Rak endometrium stanowi 50% wszystkich nowotworów złośliwych układu moczowo-płciowego u kobiet, aw 80% przypadków stwierdza się go podczas badania macicy. Przetrwanie na etapie I wynosi 80%, na IV - 10%. W 60-80% przypadków guzy mają strukturę gruczolakoraka.

Najczęściej nowotwór błony śluzowej macicy zwiększa marker nowotworowy CA 125: w stadium choroby do 22%, aw stadium III-IV - do 80%, poziom markera wynosi powyżej 35 kU / l. Nie ma markera nowotworowego do badań przesiewowych w celu wczesnego wykrywania raka endometrium. Badania morfologiczne uważane są za metodę tradycyjną.

diagnostyka raka trzonu macicy i próbki tkanek uzyskane po łyżeczkowaniu błony śluzowej macicy.

W monitorowaniu raka endometrium CA 125 uznawany jest za najlepszy marker, a u 60% pacjentów z wczesnym nawrotem guza stwierdzono wzrost stężenia surowicy w CA 125.

4.4.5. RAK PŁUC

W krajach rozwiniętych gospodarczo populacja nowotworów złośliwych raka płuca wynosi 21% w strukturze całkowitej śmiertelności. Rak płuc jest prototypem guza wywołanego przez chemiczne substancje rakotwórcze. Stwierdzono ścisły związek między rozwojem raka płuc a paleniem papierosów, ale nie wszyscy palacze rozwijają raka, ale tylko 5–10%, co wskazuje na ważną rolę predyspozycji genetycznych u tych pacjentów. W prawie 50% przypadków leczenie operacyjne może być zalecane w początkowej diagnozie, ale tylko w 70% z nich guz jest resekcyjny.

Główne typy histologiczne raka płuc to: komórki płaskonabłonkowe (PRL), gruczolakorak, rak wielkokomórkowy i drobnokomórkowy rak płuc (MRL). Należy zauważyć, że MRL różni się od innych typów histologicznych nowotworów płuc cechami jego przebiegu klinicznego. Dlatego wszystkie złośliwe nowotwory płuc dzielą się na SCLC i niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC), które są częścią heterogenicznej grupy nowotworów.

W raku płuc najczęściej badane są następujące markery: enolaza specyficzna dla neuronów (HCE), CEA, 19 fragment cytokeratyny (CYFRA 21-1), płaskonabłonkowy antygen nowotworowy (SCC), CA 125, antygen polipeptydowy tkanki (TPA).

Enolaza specyficzna dla neuronów została po raz pierwszy odkryta w neuronach mózgu i obwodowym układzie nerwowym. HSE jest izoenzymem cytoplazmatycznego enzymu glikolitycznego enolazy (hydrolaza 2-fosfo-D-glicerynianowa, EC 4.2.1.11) i składa się z dwóch niemal identycznych łańcuchów polipeptydowych typu γ, masa cząsteczkowa każdego z nich wynosi 39 000 D. W mózgu, wraz z izoformą - dimer z podjednostek typu α i hybrydowy izoenzym αγ, które mają podobne powinowactwo do substratu - kwasu 2-fosfoglicerynowego. Enolazę zawierającą tę podjednostkę γ (α-γ i γ-γ) nazwano HCE. Izoformy mogą być syntetyzowane przez komórki mózgu glejowego, jak również przez większość komórek somatycznych.

tkanki. Sam enzym jest syntetyzowany w neuronach centralnych i obwodowych oraz nowotworach złośliwych pochodzenia neuroektodermalnego (SCR, nerwiaki niedojrzałe, rakowiaki jelitowe).

Wykazano, że górna granica HSE u zdrowych ludzi wynosi 12,5 ng / ml. Biorąc jednak pod uwagę, że stężenia sięgają 20 ng / ml

i więcej, i może występować w łagodnych chorobach płuc, w diagnozie klinicznej korzystniejszy jest wyższy poziom wartości progowej markera (> 25 ng / ml). Wzrost aktywności HCE w surowicy wykryto w 40-70% pierwotnej

pacjenci z IRL i 83-98% pacjentów ze wspólnym stadium choroby.

Zgodnie z danymi dostarczonymi przez Memorial Sloan Kettering Cancer Center (USA), częstotliwość wzrostu aktywności HCE w surowicy pacjentów z SCR zależy od rozpowszechnienia procesu nowotworowego: w stadium I-II czułość testu wynosi 39%, na etapie III-IV - 87%. Należy zauważyć, że w analizie znaczenia diagnostycznego wielu autorów identyfikuje stosunkowo wysoką swoistość w porównaniu z innymi markerami. Zatem aktywność rozedmy wzrosła tylko w wyjątkowych przypadkach, w przeciwieństwie do których stężenie CEA wzrosło w 7-36% obserwacji. Wyniki badań wskazują, że HCE może być stosowany jako marker markera nowotworowego, zarówno w diagnostyce różnicowej, jak i w monitorowaniu skuteczności terapii dla MRL.

Jednocześnie stwierdzono wzrost aktywności HCE w surowicy pacjentów z gruźlicą (27,3%), a także u pacjentów zakażonych wirusem HIV w porównaniu z pacjentami niezakażonymi. Pacjenci z naciekami pęcherzykowymi lub ogniskami śródmiąższowymi w płucach również mieli znacząco podwyższone poziomy HCE w surowicy. Uważa się, że wzrost HSE w surowicy u pacjentów z łagodnymi chorobami płuc jest związany z miejscowym niedotlenieniem. Przedstawione wyniki należy wziąć pod uwagę przy analizie HCE u pacjentów z rakiem płuc iw obturacyjnych procesach płucnych.

Należy zauważyć, że biorąc pod uwagę znaczną heterogeniczność raka płuc, w szczególności wariantu małych komórek, można zauważyć istotne znaczenie diagnostyczne i prognostyczne HCE w porównaniu z innymi markerami nowotworowymi.

Antygen nowotworowo-zarodkowy, reprezentowany przez glikoproteinę o masie cząsteczkowej około 180 kD, również należy do grupy

antygeny onkofalalne, syntetyzowane i wydzielane przez komórki jelitowe zarodka i płodu, a także niektóre nowotwory złośliwe (rak piersi, żołądka, płuc). Po raz pierwszy CEA stwierdzono u pacjentów z rakiem jelita grubego. Obecnie związki podobne do CEA wykryto również na błonach komórkowych w tkankach nie zarodkowych i nienowotworowych. Istnieją wszelkie powody, by sądzić, że wątroba jest głównym miejscem metabolizmu CEA. Poziom CEA w surowicy krwi jest zwiększony u 40–80% pacjentów z nowotworami złośliwymi pochodzenia endodermalnego, u 20–30% u innych postaci raka iw 10–20% u pacjentów z łagodnymi nowotworami. Najwyższą czułość CEA i najwyższe stężenia markera stwierdzono w gruczolakoraku i raku płuca o dużych komórkach.

Antygen raka płaskonabłonkowego surowicy jest białkiem o masie cząsteczkowej 48 kDa, podobnym do serpinów (inhibitorów proteazy). Marker stosuje się w diagnostyce raka płaskonabłonkowego w różnych narządach (rak szyjki macicy, przełyku, płuc, guzów głowy i szyi). Ponad 70% pacjentów z PRL ma podwyższony poziom. Jednak tylko w 26,1% poziomu markera nowotworowego wzrasta w surowicy z gruczolakorakiem płuc i nie jest wykrywany za pomocą SCR. U 87,8% pacjentów z wczesnym nawrotem PRL obserwuje się wysoki poziom SCC w surowicy. Identyfikacja ekspresji SCC w badaniu immunohistochemicznym guzów płuc ma duże znaczenie praktyczne.

Antygen polipeptydu tkankowego jest polidyspersyjną mieszaniną cytokeratyn 8, 18 i 19 (masa cząsteczkowa od 20 do 45 kD), która może polimeryzować w roztworze z wytworzeniem oligomerów. Aktywność TPA zależy od sekwencji aminokwasowej i pozycji reszty argininy. Zwykle występuje w wysokich stężeniach w łożysku i tkankach płodowych. TPA jest zlokalizowany na błonie komórkowej i siateczce śródplazmatycznej komórek nowotworowych, jest wytwarzany przez proliferację komórek i uwalniany spontanicznie do środowiska. TPA występuje prawie we wszystkich nowotworach złośliwych.

Fragment cytokeratyny 19. Znaczenie cytokeratyny w różnicowaniu tkanki fizjologicznej i patologicznej jest od dawna znane w histopatologii. Cytokeratyny są nierozpuszczalnymi białkami komórkowymi, ponad 20 z nich jest obecnie dobrze scharakteryzowanych przeciwciałami monoklonalnymi. W przeciwieństwie

z całej cząsteczki fragmenty cytokeratyny są rozpuszczalne w surowicy. W teście na marker nowotworowy CYFRA 21-1, dwa typy przeciwciał monoklonalnych (Ks 19.1 i BM 19.21) stosuje się do wykrywania fragmentu cytokeratyny 19 o masie cząsteczkowej 30 kD. Górna granica normy u zdrowych ludzi wynosi 2,3 ng / ml. Test CYFRA 21-1 ma dobrą swoistość dla łagodnych chorób płuc, poziom progowy wynosi 3,3 ng / ml. Marker ma wysoką czułość w diagnostyce NSCLC.

Brak związku CYFRY 21-1 z paleniem. Wykazano, że poziom CYFRY 21-1 jest taki sam w surowicy pacjentów z niezłośliwymi chorobami płuc, SCLC i w grupie kontrolnej. Jednocześnie obserwowano znamiennie wyższe stężenia CYFRY 21-1 u pacjentów z NSCLC, gruczolakorakiem i PRL. Przedstawione dane potwierdziły wysoką czułość i swoistość CYFRY 21-1 w diagnostyce różnicowej między złośliwymi i niezłośliwymi chorobami płuc, a także między MRL a NSCLC. Pacjenci z przerzutami do węzłów chłonnych N2 i N3 mają najwyższy poziom CYFRY 21-1 w surowicy (5,6 ng / ml) (granice wahań 3,2–11,5 ng / ml) w porównaniu z pacjentami z N0 i N1 (3,9-10 ng / ml) (test U Manna-Whitneya; p = 0,0373).

We wszystkich typach raka płuc CYFRA 21-1 ma najwyższą czułość (57,7%) w porównaniu z CEA (45,3%) i SCC (22,6%). Chociaż połączenie CYFRA 21-1 i CEA w diagnostyce NSCLC, czułość i dokładność są zwiększone odpowiednio do 75,4 i 78,1%, ale swoistość spada do 86,5%.

Japońscy badacze (University of Tsukuba) proponują wykorzystanie oznaczenia poziomu CYFRY 21-1 w płynie opłucnowym oprócz badania cytologicznego w celu poprawy diagnozy i diagnostyki różnicowej raka płuc. Wynika to z faktu, że znaczny wzrost markera wykryto w płynie opłucnowym u pacjentów z rakiem płuc (średnio 84,5 ng / ml) w porównaniu z pacjentami z łagodnymi guzami (13,9 ng / ml). Ponadto poziom CYFRY 21-1 w płynie opłucnowym pacjentów z PRL znacznie różni się od poziomu w zapaleniu płuc, podczas gdy CEA nie ujawnia takich różnic.

Przy określaniu CYFRA 21-1 należy zdawać sobie sprawę z możliwego wzrostu poziomu do 10 ng / ml w przypadku postępujących łagodnych chorób wątroby, a zwłaszcza w niewydolności nerek. Zanieczyszczenie próbki elementami śliny może również

prowadzić do znacznego wzrostu wartości CYFRY 21-1. W takim przypadku wynik nie wpływa na płeć, wiek, palenie i ciążę. Badania wszystkich typów guzów litych wykazały, że CYFRA 21-1 jest skutecznym markerem NSCLC i PRL.

Podsumowując, rozważmy niektóre cechy zastosowania w klinice markerów wzrostu złośliwego na przykładzie raka płuc.

Po pierwsze, nie należy wykorzystywać wszystkich powyższych markerów w badaniach przesiewowych w kierunku bezobjawowego raka płuca lub u pacjentów z wysokim ryzykiem rozwoju tego typu nowotworu. Podstawowa diagnoza i podstawowe leczenie pacjentów z rakiem płuc opiera się na klinicznych i instrumentalnych metodach badania (kliniczne, endoskopowe, rentgenowskie, wyniki śródoperacyjne).

Ponadto marker NSE należy uznać za niezwykle ważny w diagnostyce immunohistochemicznej wariantu nowotworu. Często tylko oznaczenie HCE w surowicy pomaga potwierdzić rozpoznanie SCLC.

Stężenie SCC w surowicy> 2 mg / l wskazuje 95% szansy na wykrycie NSCLC i 80% płaskonabłonkowego raka płuc.

Przy stężeniach CA 125 powyżej 100 U / ml i CEA powyżej 10 mg / l należy sugerować gruczolakoraka lub raka wielkokomórkowego płuc.

Wreszcie, chociaż często stężenie CYFRA 21-1, TPA, HCE, CEA wykazuje obecność guza, nie obserwuje się tego

silny związek między wytwarzaniem markerów nowotworowych a histologicznym wariantem nowotworu płuc. W większości przypadków wysoki poziom w tym przypadku wskazuje na przewagę procesu nowotworowego, a zatem rokowanie powinno być rozczarowujące. Jednak niskie i średnie wartości tych markerów nigdy nie pozwalają całkowicie wyeliminować żadnego wariantu guza lub postępu choroby.

Pomimo wszystkich powyższych ograniczeń, markery nowotworowe w pierwotnej diagnozie raka płuc mogą być ważne w następujących sytuacjach.

Po pierwsze, antygeny związane z nowotworem wyrażane podczas początkowej diagnozy powinny być stosowane w monitorowaniu u danego pacjenta. CYFRA 21-1, REA i CA 125 są bardzo istotnymi czynnikami prognostycznymi w NSCLC i HCE w MRL.

Po drugie, spadek poziomu markerów nowotworowych w okresie pooperacyjnym (

2-3 dni dla CEA, 1 dzień dla NSE, kilka godzin

dla CYFRY 21-1) daje lekarzowi użyteczne informacje o radykalnym charakterze wykonanej operacji i skuteczności terapii, a zatem o dobrej prognozie. Z drugiej strony powolne obniżenie poziomu markera w surowicy krwi wskazuje na nieistotność przeprowadzonej operacji i sugeruje obecność resztkowych ognisk guza.

Po trzecie, stopniowy wzrost markera nowotworowego może być pierwszym objawem nawrotu choroby. Taki wzrost można wykryć 12 miesięcy przed klinicznymi objawami nawrotu. W przypadku raka płuc HCE może służyć jako kryterium diagnostyki różnicowej różnych typów histologicznych nowotworu, szczególnie w przypadkach, w których nie jest możliwe wykonanie biopsji i potwierdzenie rodzaju guza z danymi morfologicznymi.

4.5. DIAGNOSTYKA GENETYCZNA MOLEKULARNA

Głównym zadaniem nowoczesnej diagnostyki genetycznej molekularnej (MHD, diagnostyka DNA) jest wykrywanie dziedzicznych anomalii do późniejszego wykorzystania w diagnozie, sporządzenie prognozy i wybór strategii leczenia wielu chorób. Jednocześnie MHD jest uważany za znacznie szerszy niż zwykła analiza sekwencji ludzkiego genomowego DNA, ponieważ prawie zawsze można uzyskać dodatkowe informacje o chorobie dziedzicznej, analizując stan samych chromosomów, RNA i białek oraz metabolitów.

Podobnie jak inne metody biochemii klinicznej, testy genetyczne są wykorzystywane do diagnostyki różnicowej chorób. W wielu chorobach, na przykład w dziedzicznych postaciach raka lub „błędach metabolicznych”, wykrycie mutacji staje się kryterium diagnostycznym równie ważnym jak objawy kliniczne. Jednak, oczywiście, główną zaletą diagnostyki DNA jest możliwość określenia podatności na daną chorobę w stadium przedobjawowym. W niektórych przypadkach umożliwia to zapobieganie rozwojowi samej choroby poprzez interwencję chirurgiczną, terapię lekową lub zmianę stylu życia pacjenta. Ponadto, prenatalne testy DNA mogą wykryć dziedziczenie patologicznych genów i odpowiednio określić wskazania do sztucznego przerwania ciąży.

Należy zwrócić uwagę na tak obiecujący kierunek MHD, jak farmakogenetyka. Dokładne typowanie genotypu pacjenta pozwala na ocenę genów bezpośrednio związanych z absorpcją, metabolizmem i działaniem leku, tj. Istnieje realna możliwość zidentyfikowania pacjentów szczególnie wrażliwych na dany lek i uniknięcia powikłań spowodowanych nietolerancją tego leku w trakcie leczenia. W niektórych przypadkach genotypowanie pozwala również wybrać najbardziej odpowiedni lek. Już teraz można śmiało powiedzieć, że wraz z rozwojem farmakogenetyki terapia lekowa będzie coraz bardziej polegać na analizie genotypu pacjenta.

Tak więc zastosowanie MHD w praktyce klinicznej oferuje wiele możliwości nie tylko do diagnozowania i oceny ryzyka genetycznego chorób, ale także do wyboru indywidualnej terapii lekowej. Oczekuje się, że aktywny rozwój genetyki molekularnej człowieka pozwoli na postawienie diagnostyki DNA na równi z takimi niezbędnymi narzędziami w arsenale lekarza biochemika, takimi jak na przykład metody określania aktywności enzymów we krwi.

4.5.1. RODZAJE ODBUDOWY GENETYCZNEJ

W populacji zazwyczaj występuje kilka wariantów (alleli) każdego genu. Jeśli częstotliwość takich wariantów jest raczej wysoka i nie można jej wyjaśnić przypadkowym wystąpieniem identycznych mutacji w różnych rodzinach, mówimy o polimorfizmie danego locus.

Bardziej rzadkie warianty genów nazywane są mutacjami. Jaka jest granica między polimorfizmem a mutacjami? Uważa się, że polimorfizm obejmuje warianty genów występujących w formie heterozygotycznej bardziej i mutacje mniejsze niż u 1% populacji. Jednak w praktyce mutanty są często nazywane allelami, które predysponują do określonej patologii, nawet jeśli ich częstość w populacji przekracza 1%. Poniżej wymieniono rodzaje mutacji, które mogą prowadzić do zmian patologicznych.

• Mutacje missense lub substytucja nukleotydów to najczęstszy rodzaj mutacji. Podstawienie nukleotydów w niektórych pozycjach kodonów nie prowadzi do zastąpienia kodowanego aminokwasu; takie mutacje nazywane są cichymi lub synonimicznymi. Gdy kodowany aminokwas zmienia się w wyniku mutacji zmiany sensu, funkcja białka często się zmienia. Zachowanie funkcji białka obserwuje się, jeśli

aminokwas pochodzący ze zmutowanego kodonu należy do tej samej klasy strukturalnej, co normalny aminokwas. Podstawienia pojedynczego nukleotydu mają największy wpływ na białko, powodując tworzenie kodonu stop (mutacje nonsensowne). Skrócone mRNA i białko są często nieaktywne i szybko ulegają degradacji.

• Usuwanie i wstawianie. Takie mutacje różnią się długością od jednego do milionów nukleotydów i odpowiednio nazywane są delecjami mikro i makro (insercje). Zrozumiałe jest, że makromutacje wpływają na bardzo duże segmenty chromosomów (z 10 milionów par zasad), tj. staje się możliwe wykrycie ich za pomocą analizy cytogenetycznej. Mikromutacje wpływają na niewielką ilość nukleotydów, a metody ich analizy służą do ich wykrywania. Małe insercje i delecje mogą nie wpływać na działanie kodowanego białka. Fatalne konsekwencje są zwykle obserwowane, gdy liczba nukleotydów insercji / delecji nie jest wielokrotnością trzech. Gdy to nastąpi, syntezuje się przesunięcie ramki odczytu i bezsensowną sekwencję aminokwasów. Najczęściej bardzo szybko przerywa to tworzenie nowego kodonu stop. Klasycznym przykładem wpływu przesunięcia ramki na efekty delecji są dwie powiązane choroby - dystrofia mięśniowa Duchenne'a i Beckera. Oba są spowodowane mutacjami w genie dystrofiny, a 2/3 tych mutacji występuje w obu chorobach delecyjnych. Dystrofia mięśniowa Beckera jest znacznie łagodniejsza niż Duchenne'a, ale ta różnica nie jest związana z wielkością delecji. Powodem tych różnic jest to, że w większości wykrytych przypadków miodystrofii Duchenne'a delecje prowadzą do zmiany w ramce odczytu, w wyniku czego dystrofina przestaje się całkowicie formować, podczas gdy w myodystrofii Beckera zmutowana dystrofina zachowuje pewną aktywność.

• W niektórych przypadkach mutacje wpływają na niekodujące regiony DNA, które biorą udział w inicjacji transkrypcji danego genu lub splicingu mRNA. Takie zmiany mogą również prowadzić do zakłócenia struktury, stabilności lub normalnej regulacji ekspresji tego białka.

• Niestabilne lub dynamiczne mutacje zwykle rozwijają się w obszarach zawierających wiele kopii powtórzeń trinukleotydowych. W wyniku błędów replikacji DNA lub nierównego przejścia, liczba takich powtórzeń może się zwiększyć lub zmniejszyć, w wyniku czego takie mutacje zostały nazwane dynamiczne. Jeśli numer

powtórzenia przekraczają pewną wartość progową, funkcja danego lub pobliskich genów jest zakłócona. Mechanizmy wyłączania genów podczas akumulacji powtórzeń trinukleotydowych nie są całkowicie jasne. W szczególności, w zespole chromosomu kruchego X, wzrost liczby powtórzeń CGG w locus FRAXA powyżej 200 prowadzi do metylacji i inaktywacji tego genu. Wzrost liczby powtórzeń trinukleotydowych leży również u podstaw choroby Huntingtona (ponad 35 powtórzeń CAG w genie Huntingtona) i dystrofii miotonicznej (ponad 50 powtórzeń w nieulegającym translacji regionie 3 'genu DMPK kodującego kinazę białkową). Charakterystyczną cechą tych chorób jest to, że w jednej rodzinie nasilenie choroby może wzrosnąć w wielu pokoleniach z powodu ekspansji powtórzeń nukleotydowych.

Ogólnie, pojawienie się mutacji prowadzi do zmiany funkcji lub ekspresji białka. Ta zmiana objawia się jako wzrost i spadek, często aż do całkowitej utraty, funkcji lub ekspresji białka. W przypadku wzrostu funkcjonalnego możliwe jest także uzyskanie nowych funkcji przez białko.

RUCHY Z FUNKCJAMI STRAT

Zmniejszenie aktywności funkcjonalnej białka w tkance może być wynikiem zmiany zarówno struktury białka, jak i aktywności transkrypcyjnej danego genu. Na przykład, spadek poziomu ekspresji receptora LDL z powodu mutacji w regionie promotora doprowadzi do dokładnie takiej samej hipercholesterolemii, która byłaby obserwowana, gdyby syntetyzowano normalne ilości funkcjonalnie wadliwego receptora, który nie mógłby wiązać lub internalizować lipoprotein.

Zmiany w strukturze białka spowodowane substytucjami aminokwasowymi lub zakłóceniem przetwarzania mRNA w wyniku mutacji w miejscach splicingu prowadzą do pojawienia się nieprawidłowego mRNA i białek, które podlegają przyspieszonej degradacji, co powoduje zmniejszenie całkowitej ilości aktywnego białka. Na przykład trzy najczęstsze wadliwe allele genu transferazy metylowej tiopuryny kodują szybko rozkładające się białka, co powoduje gwałtowny spadek aktywności enzymu, któremu towarzyszy zwiększona wrażliwość pacjentów na tiopuryny. W innych przypadkach, takich jak talasemia, można zaobserwować delecję całego genu, co prowadzi do całkowitego braku produktu.

Mechanizmy utraty rzeczywistej aktywności funkcjonalnej białka mogą być bardzo zróżnicowane. W rezultacie mutacje mogą

zastąpienie aminokwasów, które odgrywają kluczową rolę w strukturze lub aktywności katalitycznej. W wyniku mutacji może dojść do zakłócenia normalnego przetwarzania lub transportu białka. Na przykład, najczęstsza mutacja powodująca mukowiscydozę, delecja fenyloalaniny w pozycji 506 genu CFTR, nie wpływa na syntezę lub aktywność funkcjonalną tego białka, ale zakłóca jego transport wewnątrzkomórkowy, w wyniku czego nie jest on włączony do błony plazmatycznej, a zatem traci zdolność do funkcjonowania jako kanał chlorowy.

Z reguły mutacje z utratą funkcji prowadzą do chorób z recesywnym sposobem dziedziczenia. Wynika to z faktu, że dla pełnego funkcjonowania szlaku metabolicznego zazwyczaj wystarcza ilość aktywnego białka, które jest wytwarzane przez jeden normalny allel. I większość z tych chorób.

Mniej powszechne są przypadki, w których ilość syntetyzowanego białka staje się niewystarczająca. W tym przypadku choroba zacznie się pojawiać, nawet jeśli występuje jeden zmutowany allel, a dziedziczenie staje się dominujące. Niewiele wiadomo o takich chorobach, jednym z nich jest rodzinna hipercholesterolemia spowodowana defektem genu receptora LDL. Choroba ta charakteryzuje się również efektem dawki genu, co przejawia się w fakcie, że rodzinna hipercholesterolemia jest znacznie cięższa u homozygot w porównaniu z heterozygotami.

Dominujący typ dziedziczenia przejawia się, gdy zmutowane białko nie tylko traci swoją aktywność, ale także zakłóca funkcjonowanie produktu normalnego allelu u heterozygot. Sytuacja ta została włączona do literatury zwanej efektem dominującym negatywnym. Efekt ten występuje w przypadku białek multimerycznych, które w szczególności obejmują kolageny lub dimeryczne czynniki transkrypcyjne.

MUTACJE Z FUNKCJAMI NABYCIA

Wśród szerokiej gamy funkcji wzmacniania mutacji najciekawsze z punktu widzenia biochemii klinicznej są przypadki, gdy białko uzyskuje nową funkcję. Nowo nabyta funkcja może występować na poziomach takich jak oddziaływanie enzymu z nowym substratem, nieodwracalna aktywacja białka przenoszącego sygnał lub kanału jonowego, zakłócenie normalnego procesu inaktywacji enzymu, nieprawidłowa oligomeryzacja białka lub synteza białka chimerycznego.

Błędna interpretacja Ala jest dobrym przykładem nabycia funkcji.366-Szary w genie GNAS1 kodującym podjednostkę α heterotrimerycznego białka Gs wiążącego GTP. Białko to łączy 7-domenowe receptory hormonów transbłonowych z cyklazą adenylanową. Mutacja prowadzi do podwójnej zmiany właściwości białka. Po pierwsze, uwalnianie PKB jest przyspieszane i odpowiednio zwiększa się część (aktywnego) białka ασ związanego z GTP, co prowadzi do konstytutywnej aktywacji cyklazy adenylanowej. Po drugie, białko staje się termolabilne w 37 ° C. W związku z tym we wszystkich narządach, z wyjątkiem jądra, aktywność Gs zmniejsza się, co prowadzi do rozwoju dziedzicznej osteodystrofii Albright. A w jądrze, gdzie temperatura jest niższa, białko Gs jest nieodwracalnie aktywowane, co prowadzi do testoksykozy.

Najczęstszą przyczyną nabycia funkcji jest zwiększona ekspresja genu lub naruszenie miejsca lub czasu jego ekspresji, co jest najbardziej charakterystyczne dla komórek złośliwie transformowanych.

W przypadku mutacji z nabyciem funkcji z reguły charakterystyczny jest dominujący typ dziedziczenia. W tych rzadkich przypadkach, w których mutacje z nabyciem funkcji są w stanie homozygotycznym, obserwuje się bardzo ciężkie postacie choroby, często z śmiertelnością prenatalną. Przykładem jest homozygotyczna achondroplazja, najczęstsza przyczyna karłowatości, spowodowana mutacjami w genie FGFR3, który koduje receptor czynnika wzrostu fibroblastów. Delecje miejsca chromosomu, na którym znajduje się FGFR3 w innych chorobach, nie prowadzą do nieprawidłowości szkieletowych charakterystycznych dla achondroplazji, co sugeruje wzmocnienie lub nabycie funkcji w tej chorobie. Achondroplazja występuje zawsze w postaci heterozygotycznej, ponieważ homozygotyczność dla tej cechy jest śmiertelna.

ZASADY WYSZUKIWANIA MUTACJI

Ogólne podejście do poszukiwania mutacji w ludzkim genomowym DNA opiera się na wielu zasadach.

Zastosowanie jednej lub innej metody w diagnostyce DNA zależy od dostępności informacji o możliwym typie mutacji u danego pacjenta. W przypadkach, gdy rodzaj mutacji jest nieznany, stosuje się metody przesiewowe w celu wykrycia wszelkich różnic w sekwencji nukleotydowej zmutowanych i normalnych genów. Jeśli mutacja jest znana, na przykład, została już zidentyfikowana u krewnych, inne, prostsze są używane do badania.

a jednocześnie bardziej skuteczne metody, które można nazwać metodami wykrywania znanych mutacji.

Ponadto, niezależnie od kierunkowości (przesiewania lub wykrywania) wybranej metody, należy wziąć pod uwagę, że jedna grupa metod opiera się na specyficzności par nukleotydów w tworzeniu podwójnej nici DNA, a druga na rozpoznawaniu sekwencji DNA przez enzymy.

Dla pierwszej grupy metod fragmenty sekwencji badanego genu, odpowiadające typowi dzikiemu, tj. Najczęstszemu w populacji, stosuje się jako sekwencję odniesienia. Może to być krótki starter oligonukleotydowy (około 20 nukleotydów) lub dłuższy fragment DNA użyty do hybrydyzacji. W przypadku, gdy DNA pacjenta zawiera mutację w regionie objętym próbką, pełna hybrydyzacja między zmutowanym allelem a próbką jest niemożliwa. Prowadzi to albo do braku produktu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), albo do utworzenia nieodpowiedniego dupleksu DNA zawierającego niesparowane regiony nukleotydowe, które są wykrywane różnymi metodami chemicznymi lub enzymatycznymi.

Klasycznym przykładem metody opartej na rozpoznawaniu sekwencji DNA przez enzymy jest użycie enzymów restrykcyjnych, enzymów, które rozszczepiają DNA w regionach zawierających ściśle pojedyncze sekwencje o długości 4-8 nukleotydów. Pojawienie się odchyleń w sekwencji nukleotydowej w wyniku mutacji może albo prowadzić do utraty już istniejącego miejsca cięcia dla dowolnego enzymu restrykcyjnego, albo odwrotnie, do jego wyglądu. W tej samej grupie metod stosuje się enzymy polimerazy DNA. Enzymy te syntetyzują łańcuch komplementarny dokładnie zgodnie z sekwencją jednoniciowej matrycy. Przy użyciu znakowanych bloków nukleotydowych możliwe jest określenie, w której sekwencji nukleotydy znajdują się w danej matrycy. Zasada ta leży u podstaw sekwencjonowania enzymatycznego (określanie sekwencji nukleotydowej) zgodnie z metodą Sangera, jak również w jego uproszczonych wersjach, zaprojektowanych w celu określenia sekwencji nukleotydowej krótkich odcinków DNA (mini-sekwencjonowanie).

W przytłaczającej większości przypadków, przed analizą mutacji właściwych, badany fragment genomu pacjenta jest amplifikowany przez PCR. Celem PCR jest zwykle proste mnożenie.

liczba kopii tego fragmentu, co ułatwia technicznie późniejszą analizę DNA (rys. 4.3). W większości wariantów PCR u heterozygot, zarówno normalne, jak i zmutowane allele są amplifikowane z taką samą wydajnością, a ich rozróżnianie jest przeprowadzane w kolejnych etapach. Istnieje również specyficzny dla allelu

Rys. 4.3. Schemat reakcji łańcuchowej polimerazy

PCR, w którym stosuje się startery homologiczne do allelu normalnego lub zmutowanego, co pozwala na stwierdzenie obecności mutacji już na etapie PCR przez obecność lub brak produktu amplifikacji.

Inną uniwersalną metodą powszechnie stosowaną do diagnozowania mutacji jest sekwencjonowanie DNA. Sekwencjonowanie jest używane zarówno do wyszukiwania nieznanych mutacji, jak i do potwierdzania naruszeń wykrytych innymi metodami. Istniejące metody umożliwiają bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR, pomijając klonowanie fragmentu PCR u bakterii. Zaletą sekwencjonowania jest wszechstronność i duża ilość informacji. Głównym ograniczeniem tej metody jest wysoki koszt, który nie pozwala na użycie go jako głównego przy poszukiwaniu mutacji.

Liczba istniejących metod analizy mutacji jest bardzo duża, a ich opis bez przesady będzie wymagał osobnej książki. Poniżej znajdują się opisy tylko tych metod, które są lepiej przystosowane do stosowania w praktyce klinicznej, tj. spełniają następujące wymagania: wystarczająca czułość do identyfikacji mutacji, dobra odtwarzalność, niski koszt i możliwość automatyzacji.

METODY PRZESIEWU MUTACYJNEGO

Metody mutacyjnego badania przesiewowego stosuje się w przypadkach, gdy charakter mutacji jest nieznany, a obraz kliniczny choroby dziedzicznej sugeruje, w których konkretnych genach może nastąpić przegrupowanie. Na przykład, obecność hipercholesterolemii typu IIa w połączeniu z ksantogenami ścięgien wskazuje na obecność rodzinnej hipercholesterolemii i sugeruje, że mutacji należy szukać w genach związanych z wychwytywaniem komórek LDL, głównie w genie receptora LDL. Ponieważ mutacje w tym genie z rodzinną hipercholesterolemią są bardzo zróżnicowane i mogą wpływać na całą długość genu, konieczna jest analiza dużych części DNA. Sekwencjonowanie takiego długiego fragmentu genu jest zbyt kosztowne, dlatego stosuje się prostsze metody.

ANALIZA MAKRO-RESTORUJĄCEGO BLOTOWANIA DNA

Aby wyszukać makroskopowe DNA za pomocą Southern blotting. W tej metodzie genomowy DNA jest początkowo fragmentowany przy użyciu enzymu restrykcyjnego, po czym powstały

Fragmenty DNA są rozdzielane za pomocą elektroforezy żelowej, denaturowane i przenoszone na membranę nitrocelulozową. DNA na wydruku uzyskanym z żelu (blot) inkubuje się ze znakowanym fragmentem badanego genu, który hybrydyzuje z tymi fragmentami genomowego DNA, które zawierają gen. W obecności makroskopowego DNA, który wpływa na ten gen, zestaw lub rozmiar fragmentów, z którymi znakowana próbka hybrydyzuje, będzie się różnić od normy.

Rys. 4.4. Analiza heterodupleksowa

ANALIZA HETERODUPLEKSU Poszukiwanie mikrodelecji / insercji o rozmiarze mniejszym niż 25 par zasad, jak również pojedynczych podstawień nukleotydowych jest trudniejsze. Do ich analizy często stosuje się specjalne warianty metod elektroforetycznych. Jedną z najprostszych jest analiza heterodupleksowa (rys. 4.4). W tej metodzie próbka zawierająca mieszaninę badanego normalnego (odniesienia) i zamplifikowanego fragmentu DNA jest podgrzewana w celu denaturacji DNA, a następnie schładzana przez przywrócenie dwuniciowej struktury DNA. Ponieważ obecność małych różnic w sekwencji nukleotydowej nie zapobiega hybrydyzacji, część powstałych dupleksów składa się z odniesienia i testowanego DNA. W obszarach odniesienia i testowego DNA, różniących się składem nukleotydów, normalne parowanie nukleotydów jest niemożliwe i powstaje tak zwane niedopasowanie. Dwuniciowy DNA, który ma niedopasowanie w swojej strukturze, podczas elektroforezy migruje inaczej niż w pełni komplementarny dupleks, co umożliwia wykrycie nieprawidłowo migrujących fragmentów po barwieniu DNA.

ANALIZA POLIMORFIZMU KONFORMACJI POJEDYNCZEGO DNA

Inną popularną metodą elektroforetyczną badań przesiewowych mutacji jest polimorfizm konformacji polimorfizmu pojedynczej nici (SSCP). Zasada metody opiera się na fakcie, że jeśli zdenaturowany przez ogrzewanie DNA jest ostudzony ostro, nie zostaną utworzone podwójnie dwuniciowe dupleksy, ale krótkie dwuniciowe regiony w obrębie każdego jednoniciowego fragmentu DNA (Rys. 4.5). Zwykle tworzy się kilka względnie stabilnych wariantów, które ze względu na różną konformację przestrzenną migrują na różne sposoby podczas elektroforezy. Obszary komplementarności wewnątrzczłonowej są zazwyczaj krótkie, a każda zmiana wynikająca z nawet substytucji pojedynczego nukleotydu zwykle prowadzi do zaniku tej formy dupleksu wewnątrzcząsteczkowego. W rezultacie rozkład i intensywność jednoniciowych pasm DNA zmienia się na elektroforegramie. Ta metoda nie mówi nic o naturze różnic w sekwencji nukleotydów, więc nieprawidłowe próbki muszą zostać zsekwencjonowane.

Rys. 4.5. Analiza polimorfizmu jednoniciowej konformacji DNA

ELEKTROFORESA ARCHITEKTURY DNA Β DENATURANTOWY GRADIENT Bardziej elektrycznie odtwarzalny i informacyjny niż SSCP jest analiza elektroforetyczna DNA w gradiencie denaturantu (Rys. 4.6). Oczywiście, każda substytucja nukleotydów doprowadzi do zmiany siły dupleksu DNA i będzie denaturować do pojedynczych łańcuchów w nienormalnej temperaturze lub stężeniu czynnika denaturującego w porównaniu z normalną sekwencją. W tej metodzie elektroforezę przeprowadza się w żelach poliakrylamidowych zawierających wyższe stężenie środka denaturującego w dolnej części niż w górnej części. Podczas elektroforezy normalne i zmutowane fragmenty DNA są denaturowane w różnych częściach żelu. Ponieważ mobilność powstających pojedynczych łańcuchów jest znacznie niższa,

Rys. 4.6. Elektroforeza w gradiencie denaturantu

niż dwuniciowy DNA (ze względu na cechy konformacyjne jednoniciowego DNA), denaturowany fragment gwałtownie spowalnia migrację, podczas gdy dwuniciowy DNA nadal się przemieszcza. Result W rezultacie normalne i zmutowane fragmenty DNA migrują w różnych odległościach w żelu. Czasami jako środek denaturujący nie używaj substancji chemicznej, ale gradient temperatury.

DENATUROWANIE CIEKŁEJ PŁYNNOŚCI

CHROMATOGRAFIA Różnice w sile normalnych i zmutowanych dupleksów można również wykryć stosując denaturującą wysokosprawną chromatografię cieczową. W tej metodzie fragment DNA, podobnie jak opisane powyżej metody elektroforetyczne, poddaje się gradientowi czynników denaturujących, ale analizę DNA przeprowadza się metodą chromatograficzną z użyciem detekcji spektrofotometrycznej. Ta metoda jest bardzo czuła i łatwa do zautomatyzowania, dlatego jest coraz częściej wykorzystywana do klinicznej diagnostyki DNA.

WYKRYWANIE CHEMICZNE NIEPAKOWANYCH NUKLEOTYDÓW Druga grupa metod opiera się na wykrywaniu mutacji przy użyciu enzymów lub przetwarzania chemicznego, które w szczególności niszczą obszary niekomplementarnego krycia.

Analizowany fragment DNA jest denaturowany, mieszany z próbką kontrolną zawierającą normalny DNA i chłodzony w celu utworzenia dupleksów, z których niektóre, jeśli pacjent ma mutacje, będą zawierać obszary niesparowanych zasad. Traktowanie heterodupleksu DNA hydroksyloaminą lub tetratlenkiem osmu prowadzi do modyfikacji niesparowanych nukleotydów zawierających cytozynę i tymidynę. Późniejsze leczenie piperydyną prowadzi do rozszczepienia DNA na nukleotydzie. W rezultacie rozmiar DNA jest zachowany w normalnych próbkach, a zmutowane zawierają zestaw fragmentów odpowiadających mutacjom wpływającym na nukleotydy C lub T. Ta metoda nie jest szeroko stosowana, prawdopodobnie z powodu wysokiej toksyczności użytych odczynników.

OCHRONA PRZED RNKAZY W innej metodzie obecność niesparowanych nukleotydów określa się za pomocą enzymu RNazy. Ta metoda wykorzystuje znakowaną sondę RNA odpowiadającą normalnej sekwencji genu, która hybrydyzuje z badanym fragmentem DNA (ryc. 4.7). Jako część dupleksu DNA / RNA, RNA jest odporny na RNazę, dlatego ta metoda nazywana jest ochroną przed RNazą. Jednak w regionach różniących się sekwencją nukleotydową między próbką a analizowaną próbką, parowanie nukleotydów nie występuje. Tworzenie fragmentów RNA rejestruje się za pomocą elektroforezy. Ta metoda jest jedną z najbardziej czułych i specyficznych dla badań przesiewowych mutacji, ale nie była szeroko stosowana, najwyraźniej z powodu niedogodności związanych z pracą z labilnymi sondami RNA. Istnieją inne metody oparte na rozpoznawaniu enzymów niesparowanych zasad; nie jest jasne, jak szeroko zostaną wykorzystane w diagnozie klinicznej.

PRZEGLĄD MUTACJI DIAGNOSTYCZNYCH Elektroforetyczne metody badań przesiewowych mutacji nie są bezwzględne, zazwyczaj wykrywają tylko około połowy mutacji i polimorfizmów w analizowanych fragmentach, a jedynie czułość denaturacji

elektroforeza zbliża się do 100%. W połączeniu z relatywnie niskimi kosztami i możliwością automatyzacji czyni to tę metodę coraz bardziej popularną.

Inną cechą metod przesiewowych jest to, że z pozytywnymi wynikami wymagane jest dodatkowe sekwencjonowanie lub analiza enzymów restrykcyjnych, ponieważ metody przesiewowe nie są

Rys. 4.7. Metoda ochrony RNase

podać wszelkie informacje o naturze różnic nukleotydowych. Podczas przeprowadzania diagnostyki DNA nie wystarczy wykrycie odchylenia w sekwencji nukleotydowej u pacjenta, co prowadzi do zastąpienia kodowanego aminokwasu. Konieczne jest potwierdzenie, że ta substytucja aminokwasów ma znaczenie funkcjonalne. Metoda bezpośrednia polega na uzyskaniu zrekombinowanego zmutowanego białka i określeniu jego aktywności. To czasochłonne i kosztowne podejście jest wykorzystywane głównie do celów badawczych. W praktyce częściej kierują się rodzajem substytucji aminokwasowej. W przypadku, gdy normalne i zmutowane aminokwasy należą do różnych klas strukturalnych, prawdopodobieństwo zmian funkcjonalnych w białku jest wyższe. Prawdopodobieństwo dysfunkcji białka jest jeszcze większe, jeśli mutacja dotyczy ewolucyjnie konserwowanych części genu, tj. Tych przepisów, w których ten sam aminokwas występuje w kilku gatunkach ssaków. Obecność takich miejsc zazwyczaj wpływa na syntezę, transport lub funkcjonowanie białka, a każda zmiana w nich wpływa na aktywność białka. Na przykład, analiza sekwencji genu receptora LDL chomika chińskiego, królika, szczura, myszy i Xenopus laevis wykazała, odpowiednio, 81, 79, 77, 76 i 70% homologię z ludzkim receptorem. Dostępna przez Internet baza danych UMD-LDLR zawiera szereg programów do analizy mutacji w genie receptora LDL, w tym możliwość analizy konserwatyzmu każdego segmentu genu.

Dodatkowe informacje na temat patogeniczności mutacji można uzyskać, badając krewnych pacjenta. W przypadku, gdy ta sama mutacja występuje u krewnych pacjenta z objawami tej choroby (na przykład podwyższone poziomy cholesterolu w rodzinnej hipercholesterolemii), ale nie występuje u zdrowych osób (ponad 100 dawców jest zwykle badanych przesiewowo bez objawów tej choroby), prawdopodobieństwo, że Ta mutacja jest patogenna, bardzo wysoka.

Ogólnie, pomimo niewyczuwalnej wrażliwości metod przesiewowych mutacji, stosunek zawartości informacji do kosztu tych metod jest dość wysoki i są one powszechnie stosowane w praktyce. Należy jednak pamiętać, że ich negatywna siła predykcyjna jest niewielka. Innymi słowy, brak jakichkolwiek cech próbki DNA analizowanych metodami przesiewowymi nie oznacza, że ​​DNA nie zawiera mutacji.

METODY WYKRYWANIA MUTACJI

W przypadku, gdy znane są możliwe warianty rearanżacji genetycznych i nie ma ich zbyt wiele, można użyć metod, które są szybsze i tańsze niż metody badań przesiewowych. Metody te opierają się na hybrydyzacji DNA lub zdolności enzymów restrykcyjnych do rozpoznawania dobrze zdefiniowanych sekwencji nukleotydowych lub polimeraz DNA do syntezy DNA komplementarnego do matrycy (mini-sekwencjonowanie).

Rys. 4.8. Analiza ograniczeń

ANALIZA OGRANICZEŃ Najprostszą metodą wykrywania mutacji jest analiza restrykcyjna (ryc. 4.8). Podstawą tej metody jest bardzo wysoka specyficzność endonukleaz restrykcyjnych w odniesieniu do pewnych sekwencji nukleotydowych. Każdy z tych enzymów bakteryjnych rozpoznaje ściśle indywidualną sekwencję 4-8 nukleotydów i tnie podwójną nić DNA wewnątrz lub w pobliżu tego miejsca. Wystarczy zastąpić jeden nukleotyd, aby naruszyć ograniczenie tego enzymu. W przypadkach, w których polimorficzny nukleotyd jest częścią miejsca restrykcyjnego, może być genotypowany z 100% niezawodnością przy użyciu enzymu restrykcyjnego. Podstawienia nukleotydowe najczęściej naruszają istniejące miejsca restrykcyjne, ale czasami tworzą nowe miejsca. Wadą tej metody jest to, że nukleotydy polimorficzne nie zawsze leżą w miejscach rozpoznawania dowolnej restrykcji. Częściowe rozwiązanie jest możliwe w przypadkach, gdy obszar, w którym znajduje się mutacja, zawiera przynajmniej niektóre nukleotydy, które tworzą miejsce restrykcyjne. Kompletne miejsce restrykcyjne można utworzyć sztucznie podczas PCR. Aby to zrobić, użyj starterów, które nie odpowiadają w pełni sekwencji nukleotydów w obszarze mutacji, ale zawierają 1-2 nukleotydy niekomplementarne, które uzupełniają miejsce restrykcyjne, które będzie zawierać nukleotyd polimorficzny. Zazwyczaj wprowadzenie niewielkiej liczby zasad niekomplementarnych nieznacznie zmniejsza skuteczność PCR, dlatego po amplifikacji w produkcie pojawia się nowe miejsce restrykcyjne, w które zaangażowany jest również nukleotyd polimorficzny. Dalszą analizę restrykcyjną przeprowadza się w taki sam sposób jak w metodzie standardowej.

ALLELSPECIFIC PCR W niektórych przypadkach PCR można wykorzystać do wzbogacenia badanego fragmentu genomowego DNA, ale do bezpośredniego wykrycia mutacji (Rys. 4.9). W tym przykładzie wykonania jeden ze starterów hybrydyzuje z regionem DNA, w którym znajduje się polimorficzny nukleotyd. Temperaturę hybrydyzacji starterów wybiera się tak, aby wiązanie startera i późniejszej amplifikacji zachodziło tylko z całkowitą zbieżnością sekwencji DNA i starterów. Na przykład, gdy starter odpowiadający zmutowanej sekwencji wiąże się z normalnym DNA, powstaje niesparowany nukleotyd, co zmniejsza siłę wiązania startera do DNA. Przy wystarczająco wysokiej temperaturze wyżarzania podkładu

Rys. 4.9. Reakcja łańcuchowa polimerazy specyficzna dla allelu

zazwyczaj przestaje wiązać się z normalnym allelem, PCR nie zachodzi i produkt nie kumuluje się. Zazwyczaj reakcja z primerem odpowiadającym normalnemu allelowi jest równoległa. Ta reakcja służy jako kontrola dodatnia, pokazując normalny przebieg amplifikacji. Ponieważ obecność jednego niedopasowania może nieznacznie zmniejszyć siłę wiązania startera do DNA, czasami do sekwencji startera wprowadza się drugie niedopasowanie w celu dalszej destabilizacji dupleksu i zmniejszenia wydajności produktu w obecności niesparowanego nukleotydu w regionie polimorficznym.

PCR AL REAL REMAINS

Zaletą opisanej powyżej metody PCR specyficznej dla allelu jest zmniejszenie liczby etapów w procedurze analizy, ponieważ nie wymaga ona przetwarzania produktu z restrykcjami lub zastosowania złożonych metod elektroforetycznych.

Co więcej, metoda jest przyspieszana za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR). W tej metodzie tworzenie produktu nie jest monitorowane przez elektroforezę, jak w standardowej metodzie PCR, ale bezpośrednio podczas PCR dla akumulacji dwuniciowego DNA w medium reakcyjnym. Akumulację DNA określa się po każdym cyklu polimeryzacji przez zwiększenie fluorescencji barwnika SYBR Green lub jego analogów, których fluorescencja dramatycznie wzrasta w przypadku interakcji z dwuniciowym DNA, ale nie zależy od obecności nukleotydów lub starterów. Instrumenty do RT-PCR są kombinacją wzmacniacza PCR i fluorymetru. Po zakończeniu amplifikacji specyficzność otrzymanego produktu można określić przez pomiar temperatury topnienia, która jest monitorowana przez redukcję fluorescencji SYBR Green.

BADANIE TAQMAN Istnieją inne sposoby rejestracji produktu PCR bezpośrednio w mieszaninie reakcyjnej bez elektroforezy. Metoda, opatentowana przez Hofmanna LaRoche, opiera się na wykrywaniu amplifikowanego DNA przy użyciu sondy oligonukleotydowej, która hybrydyzuje z centralną częścią amplifikowanej sekwencji. Na końcach próbek oligonukleotydów, zwanych TaqMan, znajdują się nukleotydy znakowane dwoma różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, z których jeden gasi fluorescencję drugiego. W wyniku wygaszania poziom fluorescencji drugiego barwnika jest mały. Polimeraza Taq, która uzupełnia nową nić z jednego ze starterów, rozdziela próbkę TaqMan, która wiąże się ze środkiem amplifikowanego regionu DNA, ze względu na jego aktywność egzonukleazy, co powoduje, że fluorescencyjnie znakowane nukleotydy są uwalniane do roztworu i efekt wygaszania znika, ponieważ jest obserwowany tylko w przypadek, gdy fluorofory znajdują się blisko siebie. W rezultacie fluorescencja barwnika wzrasta tym bardziej, że więcej próbek oligonukleotydowych ulega zniszczeniu przez polimerazę DNA podczas amplifikacji, tj. im więcej powstaje produkt. Ta metoda jest również używana do analizy mutacji. W tym celu stosuje się dwie próbki TaqMan, znakowane różnymi parami fluoroforów i różniące się sekwencją nukleotydową w regionie polimorficznym, z których jeden odpowiada typowi dzikiemu, a drugi mutantowi. Degradacja próbki polimerazy DNA

Rys. 4.10. Sondy TaqMan. P - barwnik reporterowy, fluorescencja wygaszacza T

jest przeprowadzana w temperaturze, w której przechowywane są tylko w pełni komplementarne kompleksy między analizowanym fragmentem a próbkami. Poprzez zwiększenie fluorescencji barwników, które tworzą próbkę normalną lub zmutowaną, możliwe jest określenie, które warianty są obecne w analizowanej próbce. Ta metoda pozwala na niezawodne rozróżnienie między hetero i homozygotycznymi nosicielami mutacji.

PIECE MOLEKULARNE Inna metoda wykrywania mutacji, oparta na efekcie wygaszania fluorescencji, jest implementowana w metodzie molekularnych beaconów (rys. 4.11). Oligonukleotyd nazywany jest boją, której 3'- i 5'-końce są oznaczone dwoma barwnikami, z których jeden działa jako wygaszacz. W przeciwieństwie do próbek TaqMan, boje są dłuższe i zawierają blisko siebie krótkie, uzupełniające się części, które w zwykłej temperaturze wyżarzały się, tworząc strukturę spinki do włosów. W tym przypadku barwniki znajdujące się na końcach oligonukleotydu zbliżają się do siebie i fluorescencja jednego barwnika jest wygaszana przez inny. W środku boi sekwencja nukleotydów odpowiada badanemu regionowi DNA. Po denaturacji przez ogrzewanie, prowadzącej do stopienia części szpilki do włosów, mieszanina DNA z pławami jest chłodzona, co umożliwia utworzenie dupleksu boi z analizowanym DNA. Po dalszym ochłodzeniu kołki są ponownie formowane w swobodnych bojach, a fluorescencja zmniejsza się. W przeciwieństwie do beaconów związanych z analizowanym DNA,

Rys. 4.11. Metoda beaconów molekularnych. P - barwnik reporterowy, fluorescencja wygaszacza T

barwniki pozostają odległe od siebie, a ich fluorescencja pozostaje wysoka. Hybrydyzacja badanego DNA z wiaderkami zawierającymi normalną lub zmutowaną sekwencję nukleotydową w centralnej części umożliwia określenie genotypu badanego DNA.

HYBRYDYZACJA Z WSZYSTKIMI SPECJALNYMI

Metoda ta opiera się na hybrydyzacji badanego DNA z oligonukleotydami homologicznymi do miejsca mutacji i otaczającej sekwencji. Ta metoda istnieje w dwóch formach. Czasami produkt PCR jest unieruchomiony na podstawie stałej, a znakowane oligonukleotydy dodaje się w roztworze. Warunki prania są wybierane w taki sposób, że dupleksy zawierające niesparowane bazy są niszczone. W rezultacie na matrycy pozostają tylko oligonukleotydy w 100% komplementarne do analizowanego DNA. Dodając oligonukleotydy odpowiadające sekwencyjnie do wariantu normalnego lub zmutowanego, możliwe jest określenie, który nukleotyd jest obecny w analizowanym DNA. W drugim wariancie tej metody oligonukleotydy unieruchamia się na matrycy, z którą znakowany produkt PCR hybrydyzuje.

Zaletą metody hybrydyzacji z oligonukleotydami jest możliwość jej miniaturyzacji, gdy szeroki zestaw oligonukleotydów jest unieruchomiony na mikroprocesorze, co pozwala na jednoczesne wykrycie wielu mutacji. Główną trudnością tej metody jest potrzeba ścisłego wyboru warunków hybrydyzacji i przemywania niekompletnie komplementarnego DNA. Nie jest jasne, jak szeroko ta metoda będzie stosowana w praktycznej diagnostyce DNA.

REAKCJA LIGASOWA WSZYSTKICH WSZYSTKICH Skuteczną metodą wykrywania podstawień pojedynczych nukleotydów i krótkich rearanżacji jest reakcja ligazy (rys. 4.12). Analizowany DNA hybrydyzuje z dwoma oligonukleotydami, z których jeden kończy się nukleotydem, komplementarnym do miejsca polimorficznego, a drugi bezpośrednio z nim sąsiaduje. Po zakończeniu hybrydyzacji enzymowa ligaza DNA sieciuje oligonukleotydy, tworząc dłuższy fragment, który znacznie różni się od oryginalnych oligonukleotydów w mobilności

Rys. 4.12. Reakcja ligazy specyficzna dla allelu

z elektroforezą. Jeśli oligonukleotydy nie są w pełni komplementarne do fragmentu DNA i po hybrydyzacji powstaje niesparowany nukleotyd w regionie polimorficznym, ligaza nie sieciuje takich oligonukleotydów i nie tworzy się długi fragment. Tak więc, przeprowadzając reakcję ligazy z jedną wspólną i jedną z dwóch próbek specyficznych dla allelu, można genotypować próbkę DNA dla danego nukleotydu.

W tej metodzie produkt PCR hybrydyzuje się z wiązaniem oligonukleotydowym po stronie b 'miejsca polimorfizmu (rysunek 4.13). Po hybrydyzacji do mieszaniny reakcyjnej dodaje się polimerazę DNA i jeden z czterech zmodyfikowanych nukleotydów. W tej reakcji stosuje się fluorescencyjnie znakowane dideoksynukleotydy, w wyniku których polimeraza DNA może wypełnić tylko jeden nukleotyd komplementarny do tego znajdującego się w analizowanej pozycji. Dlatego reakcja zachodzi tylko w probówce, w której dodaje się nukleotyd, komplementarnie do analizowanego. W niektórych przypadkach wszystkie cztery nukleotydy są obecne w mieszaninie reakcyjnej, ale znakowane różnymi barwnikami. Analiza fluorescencyjna na czterech długościach fali pozwala określić, który nukleotyd jest aktywowany i odpowiednio analizowany nukleotyd jest do niego komplementarny. Ponieważ metoda ta wykorzystuje tę samą zasadę, co w sekwencjonowaniu enzymatycznym DNA, często nazywana jest mini sekwencjonowaniem.

Istnieją inne metody określania mutacji w oparciu o aktywność polimerazy DNA. W jednym z nich, zwanym pyrosekwencjonowaniem, każdy etap wydłużania łańcucha polimerazy DNA jest rejestrowany przez tworzenie pirofosforanu, który jest monitorowany za pomocą sprzężonych reakcji enzymatycznych, powodując wybuch chemiluminescencji w odpowiedzi na tworzenie się pirofosforanu (Rysunek 4.14). Ta metoda pozwala na sekwencjonowanie tylko bardzo krótkich odcinków DNA, więc jego głównym zastosowaniem jest analiza mutacji. Analizowany nukleotyd jest identyfikowany przez dodanie, który z czterech nukleotydów (konwencjonalne nukleotydy są stosowane w tej metodzie) spowodował wybuch chemiluminescencji.

Rys. 4.13. Mini sekwencjonowanie

Rys. 4.14. Zasada sekwencjonowania DNA

WYKRYWANIE MUTACJI Β DIAGNOSTYKA Po prawidłowym zastosowaniu metody wykrywania określają obecność lub brak mutacji o bardzo wysokiej czułości i swoistości, co pozwala na wykorzystanie informacji uzyskanych tymi metodami do podejmowania bardzo ważnych decyzji, takich jak konieczność przerwania ciąży podczas diagnozy prenatalnej.

Istnieją dwie metody diagnozy prenatalnej. Amniocenteza polega na selekcji około 10 ml płynu owodniowego przez ścianę brzucha (ryc. 4.15). Optymalny termin

Rys. 4.15. Amniocenteza

przeprowadzenie - 16. tydzień ciąży. Komórki płodowe izoluje się z cieczy przez odwirowanie i natychmiast analizuje metodą PCR lub umieszcza w hodowli. Komórki w kulturze dzielą się i po pewnym czasie są wystarczające do przeprowadzenia analizy chromosomalnej, a później - biochemicznej. Druga metoda, biopsja kosmówki, jest możliwa we wcześniejszych stadiach ciąży, w 10-12 tygodniu (ryc. 4.16). Procedura ta składa się z biopsji przezbrzusznej lub przezcewkowej kosmków kosmówkowych. Komórki chorionowe można hodować lub analizować natychmiast, jeśli jest wystarczająca ilość materiału do analizy DNA. Jeśli wykryte zostaną nieprawidłowości chromosomalne lub mutacje, ciąża może zostać przerwana przez rodziców.

Przeprowadzenie prenatalnej diagnozy mutacji ma sens, gdy istnieje wiarygodna metoda wykrywania mutacji obecnej w danej rodzinie. W niektórych przypadkach można to określić

Rys. 4.16. Biopsja kosmówkowa

czy płód odziedziczył chorobę dziedziczną, nie znając dokładnej lokalizacji mutacji, ale opierając się na analizie genetycznego powiązania choroby w rodzinie. Jednak nie zawsze jest to możliwe, ponieważ do analizy fuzji wymagane są próbki DNA od kilku chorych krewnych i dużej liczby zdrowych członków rodziny.

4.5.2. CECHY APLIKACJI DIAGNOSTYCZNEJ DNA

Maksymalna wartość diagnostyczna testów genetycznych jest obserwowana w przypadkach, w których istnieje wysoka korelacja między obecnością defektu genetycznego a prawdopodobieństwem rozwoju patologii, to znaczy dla chorób o wysokiej penetracji.

Choroby takie doświadczają stałej presji doboru naturalnego, w wyniku czego ich częstość w populacji ogólnej jest zazwyczaj mała. Pod tym względem większość stosowanych testów genetycznych wiąże się z diagnozowaniem rzadkich form chorób. Nawet najpowszechniejsze formy ludzkich chorób monogenowych, opisane poniżej, manifestują się klinicznie nie częściej niż u jednej osoby na kilkaset.

Powszechne choroby ludzkie, takie jak nadciśnienie, cukrzyca, choroby sercowo-naczyniowe, chociaż zależne od czynników genetycznych, mają niską penetrację, złożoną, zmienną i słabo badaną strukturę genetyczną, dlatego pomimo oczywistej potrzeby poszukiwania genetycznej predyspozycji do powszechnych chorób, wyniki takich badania w praktyce są bardzo ograniczone.

CZYNNIKI EFEKTYWNOŚCI Stosunek informacyjności wyników diagnostyki DNA do kosztów jej wdrożenia jest w dużej mierze uzależniony od złożoności genetycznej choroby. Przykłady obejmują hemochromatozę, w której dwie mutacje powodują prawie wszystkie przypadki kliniczne wśród białej populacji i rodzinną hipercholesterolemię, która może być spowodowana przez ponad 800 mutacji w genie receptora LDL, z których żadna nie jest częstsza niż u 1% pacjentów z rodzinna hipercholesterolemia. Większość chorób dziedzicznych ma charakter pośredni w tym zakresie, zbliżając się do rodzinnej hipercholesterolemii, gdy koszt diagnostyki DNA może ograniczyć jej wdrożenie.

W pewnych warunkach złożoność diagnozy, a tym samym jej koszt, może zostać zmniejszona. Jest to możliwe w populacjach, w których struktura genetyczna choroby jest prostsza niż w innych populacjach. Efekt ten jest najbardziej widoczny w populacjach z tzw. Efektem założyciela. Ten termin genetyczny oznacza, że ​​znaczna część populacji odziedziczyła pewną mutację od jednego z jej założycieli przodków. Z powodu tego czysto przypadkowego zdarzenia w tej populacji, większość przypadków tej choroby jest spowodowana przez tę mutację. Typowym przykładem związanym z badaniami genetycznymi jest populacja Afrykanerów, mieszkańców południowej Afryki pochodzenia północnoeuropejskiego. Współcześni Afrykanie to potomkowie niewielkiej liczby rodzin z Holandii, którzy wyemigrowali do Afryki w XVII-XVIII wieku. Wśród Afrykanerów hipercholesterolemia rodzinna, prowadząca do wczesnego rozwoju choroby wieńcowej, jest kilkakrotnie częstsza niż w populacji europejskiej lub amerykańskiej. Ponadto zdecydowana większość (> 95%) przypadków rodzinnej hipercholesterolemii w południowoafrykańskiej populacji białej wynika z obecności jednej z trzech mutacji receptora LDL. Taka jednorodność genetyczna kontrastuje ostro ze strukturą genetyczną rodzinnej hipercholesterolemii w innych krajach, gdzie opisano setki mutacji, z których żadna nie jest częstsza niż u 1-2% pacjentów. Wydaje się, że kilka rodzin imigrantów (co najmniej trzy) miało mutacje, obecnie nazywane afrikanerskimi, które stały się główną przyczyną rodzinnej hipercholesterolemii u ich potomków. Z punktu widzenia medycyny praktycznej, badania genetyczne molekularne białych ludzi w Południowej Afryce na obecność rodzinnej hipercholesterolemii są dość skutecznym i stosunkowo niedrogim podejściem, które pozwala na przedobjawowe rozpoznanie tej choroby. Inaczej niż w Republice Południowej Afryki, inne kraje wymagają znacznie droższego arsenału metod molekularnych, aby dokonać takiej diagnozy.

W przypadku innych chorób dziedzicznych występuje również różnica w częstości mutacji między populacjami. Na przykład mutacja zmiany sensu cis282

Opona w genie HFE, prowadząca do rozwoju hemochromatozy, jest dość powszechna w populacjach europejskich, gdzie częstotliwość jej nosicieli wynosi do 10-15%. Natomiast w populacjach rdzennych mieszkańców Afryki, Azji i Australii

Ta mutacja jest bardzo rzadka. Przypuszcza się, że mutacja Cis282-Opona powstała w Europie około 2000 lat temu.

Oprócz efektu założyciela, drugim mechanizmem biologicznym, który upraszcza poszukiwanie mutacji nawet w populacji genetycznie otwartej, jest obecność gorących punktów mutacji w genach. Udowodniono, że prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji różni się w obszarach genomu o różnej zawartości nukleotydów GC. Znana jest również sekwencja, w której zatrzymuje się polimerazę DNA; w takich regionach sporadyczne delecje często występują w różnych genach. Z powodu tych czynników mutacje nie są równomiernie rozłożone na długości genu, ale koncentrują się w pewnych obszarach, co upraszcza ich wyszukiwanie.

Tak więc, w celu skutecznej diagnostyki DNA, potrzebne są informacje na temat najczęstszych mutacji prowadzących do rozwoju tej choroby w populacji, do której należy pacjent.

CZYNNIKI WARTOŚCI DIAGNOSTYCZNEJ

W wielu dziedzicznych zaburzeniach metabolicznych obecność choroby można podejrzewać podczas analizy biochemicznej. Na przykład pacjenci z rodzinną hipercholesterolemią zwykle mają podwyższony poziom cholesterolu LDL, aw hemochromatozie zwiększa się nasycenie transferyny żelazem. Parametry biochemiczne podlegają zmienności u każdego osobnika. W rezultacie, osoby, na przykład, z podwyższonym poziomem cholesterolu LDL, zaleca się powtarzanie testów w odstępie 3 miesięcy, aby upewnić się, że wykryte odchylenie metaboliczne jest wiarygodne. W niektórych przypadkach wskaźniki biochemiczne znajdują się w tzw. Szarej strefie, co dodatkowo komplikuje diagnozę. Tutaj może pomóc diagnostyka DNA. Obecność mutacji pokazuje uśrednione predyspozycje przez całe życie, aby przenieść ten parametr biochemiczny na stronę patologiczną, by tak rzec, gotowość patologiczną. W przeciwieństwie do fenotypu biochemicznego genotyp nie podlega indywidualnym i populacyjnym zmianom charakterystycznym dla parametrów biochemicznych. Zatem diagnostyka DNA pozwala potwierdzić diagnozę biochemiczną niezależną metodą, a także wykluczyć obecność innych przyczyn tego zaburzenia biochemicznego. Oczywiście maksymalna informatywność diagnozy DNA dziedzicznych zaburzeń metabolicznych jest osiągnięta, gdy jest połączona z klasycznymi metodami biochemicznymi.

Omawiając specyfikę i czułość metod diagnostyki DNA, należy najpierw określić, o co chodzi - określenie konkretnej mutacji lub poszukiwanie nieznanego zaburzenia genetycznego u pacjenta. W przypadku specyficznej mutacji, dla której opracowano niezawodne metody wykrywania, czułość i specyficzność wykrywania są bliskie 100%. Aby określić wartość diagnostyczną całkowitego testu molekularnego, należy wziąć pod uwagę czułość wykrywania mutacji w połączeniu z ich penetracją.

Dodatnia wartość diagnostyczna testu jest w dużej mierze określona przez przenikanie mutacji. Na przykład wykrycie trisomii na chromosomie 21 lub mutacje specyficzne dla dystrofii mięśniowej Duchenne'a lub choroby Huntingtona sugeruje, że te osoby z prawdopodobieństwem bliskim 100% mają lub będą rozwijać odpowiedni zespół kliniczny. Jednak tak wysoka dodatnia wartość diagnostyczna nie jest typowa dla wszystkich testów genetycznych. Przy niskich mutacjach penetracji, na przykład u nosicieli mutacji hemochromatozy, prawdopodobieństwo wystąpienia objawów klinicznych nie przekracza kilku procent. W takich przypadkach wykrycie wady wskazuje jedynie na predyspozycję do rozwoju tej choroby, która silnie zależy od obecności dodatkowych czynników dziedzicznych i czynników środowiskowych.

Im prostsza i bardziej badana struktura genetyczna tej choroby, tym łatwiej jest wykryć mutację i wyższą czułość testu. Niestety, ogromna większość chorób genetycznych jest spowodowana szeroką gamą mutacji, często zlokalizowanych w różnych genach. W połączeniu z ograniczonymi możliwościami nowoczesnych metod molekularnych zmniejsza to czułość molekularnych testów genetycznych. Na przykład obecnie, nawet w najlepszych laboratoriach genetyki molekularnej pracujących z pacjentami z rodzinną hipercholesterolemią, mutacje można wykryć tylko u połowy pacjentów ze zweryfikowaną diagnozą kliniczną. Innym przykładem jest myodystrofia Duchenne'a. W tym przypadku choroba delecji w genie dystrofiny może być wykryta tylko w 70% przypadków, a reszta pacjentów wymaga dodatkowej analizy histologicznej biopsji mięśni. W przypadkach, w których test nie jest w stanie wykryć wszystkich zmian genetycznych, które prowadzą do choroby, jego negatywna moc predykcyjna jest niska.

W niektórych sytuacjach negatywna moc predykcyjna testów DNA może być bardzo wysoka. Mówimy o diagnostyce prenatalnej i przedobjawowej w przypadkach, gdy znane są mutacje patogenne obecne u rodziców. W takiej sytuacji wysoka dokładność metod molekularnych pozwala z wystarczającą rzetelnością pokazać nie tylko obecność, ale także brak mutacji rodzicielskich u płodu lub dziecka.

Podsumowując, możemy powiedzieć, że większość molekularnych testów genetycznych ma znaczną pozytywną moc predykcyjną, co sprawia, że ​​wskazane jest używanie ich w klinice, szczególnie w przypadku wysokiej penetracji i patogeniczności mutacji. W przeciwieństwie do tego, negatywna moc predykcyjna większości testów molekularnych jest niewielka, z wyjątkiem sytuacji, gdy wiadomo, które mutacje występowały u rodziców.

4.5.3. PRZYKŁADY WYKORZYSTANIA DIAGNOSTYKI DNA W KLINICY

Jak dobrze wiadomo, klasyczna genetyka medyczna opisuje monogeniczne choroby o wysokiej penetracji i poważne klinicznie. Częstotliwość takich chorób zwykle nie przekracza 1 na 5000 ludności. Około tysiąca monogenicznych chorób dziedzicznych można wykryć za pomocą analizy DNA. Lista testów i wykonujących je laboratoriów jest stale aktualizowana w Internecie (http://www.geneclinics.org). Większość diagnostyki DNA jest obecnie wykorzystywana w poradnictwie genetycznym i diagnostyce prenatalnej w celu zapobiegania narodzinom dzieci z patologią.

Jednakże, oprócz klasycznych przypadków monogenicznych, choroby dziedziczne są często spotykane w klinice, które charakteryzują się stosunkowo niską penetracją i stosunkowo łagodnym przebiegiem. Tradycyjnie przypisywano je monogeniczności, jednak zgromadzone dane wskazują ostatnio na bardziej oligogeniczny charakter tych chorób.

Poniżej przedstawiono szczegółowe omówienie kilku typowych ludzkich chorób oligogennych, takich jak hemochromatoza, dziedziczna trombofilia, rodzinna hipercholesterolemia, mukowiscydoza i kardiomiopatia przerostowa. Heterozygotyczni nosiciele mutacji prowadzących do tych chorób występują w populacji z częstością 1 na 500 do 1 na 20 osób. Ze względu na dużą częstość występowania choroby w tej grupie, znaczna

całkowity wkład w ludzką patologię, prawdopodobnie przekraczający udział rzadkich chorób dziedzicznych. W przypadku wszystkich tych chorób badanie DNA umożliwia diagnozę przedobjawową oraz hemochromatozę, trombofilię i hipercholesterolemię, a następnie profilaktykę, zarówno farmakologicznie, jak i zmianę stylu życia.

Jest to jeden z najczęstszych genetycznych zaburzeń metabolicznych zwanych wrodzonymi błędami metabolicznymi, Hemochromatoza (GC) występuje u 1 na 200–300 osób w północnej Europie.

Klasyczna triada - cukrzyca, marskość i pigmentacja skóry („cukrzyca brązowa”) - została opisana już w 1865 r., Aw 1935 r. Udowodniono rodzinny charakter tej choroby. Podstawą objawów klinicznych GC jest defekt biochemiczny - nadmierne gromadzenie żelaza w komórkach miąższowych wątroby, trzustki, serca i przedniego płata przysadki mózgowej. Aby zapobiec rozwojowi objawów klinicznych, można zastosować bardzo prosty i jednocześnie skuteczny sposób - zapobiegawcze upuszczanie krwi. Pośredni fenotyp GC to podwyższony poziom żelaza w osoczu i wątrobie, co ocenia się za pomocą różnych testów biochemicznych, takich jak wysycenie transferyny żelazem, stężenie ferrytyny i zawartość żelaza w wątrobie.

Objawy kliniczne GC są bardzo zróżnicowane. Jednym z najczęstszych objawów jest przewlekłe uszkodzenie miąższu wątroby. Charakterystyczną cechą jest ogólne lub lokalne wzmocnienie pigmentacji skóry. 30-60% pacjentów z zaawansowaną chorobą ma cukrzycę. We wczesnych stadiach GC objawiają się niespecyficzne objawy, takie jak letarg, powiększenie wątroby, artropatia, kardiomiopatia, cukrzyca, przebarwienia skóry lub hipogonadyzm. Objawy kliniczne zależą od czynników genetycznych i zewnętrznych, takich jak zawartość żelaza w diecie, dawstwo krwi i fizjologiczna utrata krwi u kobiet podczas miesiączki.

W 1996 r. Zidentyfikowano gen odpowiedzialny za najczęstszą postać GC, którą nazwano HFE. Gen ten koduje białko transbłonowe składające się z krótkiej domeny cytoplazmatycznej, regionu transbłonowego i trzech domen zewnątrzkomórkowych, które oddziałują z β2-mikroglobulina na powierzchni komórki. Białko HFE wiąże się na powierzchni enterocytu z receptorem transferyny i zmniejsza powinowactwo do przenoszenia transferyny

żelazo W przypadku braku funkcjonalnie aktywnego HFE, wiązanie i późniejsza endocytoza wzrostu transferyny, co prowadzi do akumulacji żelaza wewnątrz komórki, gdzie jest ona przechowywana jako kompleks z ferrytyną. Wśród pacjentów pochodzenia celtyckiego z klinicznie ciężką GC około 90% jest homozygotycznych pod względem mutacji Cis282-Opona w genie HFE, a większość pozostałych ma kombinację Cys282-Tyr i kolejna mutacja - GiSbz-Asp. W wyniku mutacji Cis282-Tyr zakłóca tworzenie wiązania disiarczkowego w jednej z zewnątrzkomórkowych domen białka HFE, jego konformacja jest zaburzona, a białko pozostaje po syntezie w retikulum endoplazmatycznym. W rezultacie białko przestaje być wyrażane na powierzchni komórki, co prowadzi do zwiększonego wychwytu żelaza, które jest niewystarczające do potrzeb organizmu. W większości populacji Caucasoid częstość heterozygotycznych nosicieli allelu Cis282-Zakres wynosi około 10%, a dla basków i Irlandczyków pochodzenia celtyckiego częstotliwość tego polimorfizmu może osiągnąć 30%. W przeciwieństwie do Europejczyków mutacja ta prawie nigdy nie występuje u mongoloidów i czarnych. Przypuszcza się, że mutacja Cis282-Opona powstała około 2000 lat temu w populacji Celtów i rozprzestrzeniła się w całej Europie z powodu migracji ludności, tj. Przyczyną wysokiej częstotliwości tej mutacji jest efekt założycielski.

Istnieją inne choroby o obrazie klinicznym przypominającym klasyczną rodzinną GC (również klasyfikowaną jako GC typu 1), ale o innym pochodzeniu. Młodzieńczy GC (typ 2), jak również GC typu 1, jest dziedziczony w sposób autosomalny recesywny i jest spowodowany mutacjami nieznanego genu. Typ 3 GC jest również chorobą recesywną i jest związany z mutacją w receptorze transferyny. GC typu 4 i 5 są dziedziczone głównie i są powodowane przez mutacje w genach ferroportyny, transportujących żelazo odpowiednio w jelicie i ferrytynie. Wszystkie te formy są bardzo rzadkie i dziś ich definicja nie odgrywa praktycznej roli.

Opona w genie HFE charakteryzuje się wysoką penetracją w odniesieniu do fenotypu pośredniego, to znaczy biochemicznego znaku nadmiaru żelaza w organizmie. 95% mężczyzn w wieku powyżej 40 lat, którzy są homozygotami z powodu tej mutacji, ma nadmiar żelaza i występują objawy kliniczne i przedmiotowe. Kobiety w okresie przedmenopauzalnym mają mniejsze ryzyko z powodu utraty krwi podczas

miesiączka. Fenotypowy efekt mutacji GiSbz-Asp jest mniej wyraźny. Zwłóknienie lub marskość wątroby wykrywa się analizując biopsję u 4-25% homozygotycznych nosicieli allelu Cis282

Strzelnica Ponadto allel Cis282-Tir predysponuje do rozwoju raka wątrobowokomórkowego. U mężczyzn z GC i marskością wątroby względne ryzyko rozwoju raka wątrobowokomórkowego jest 200 razy wyższe.

TESTOWANIE MEDIÓW

Obecność powyższych objawów jest wskazaniem do badań genetycznych na GC. Diagnoza jest jednak diagnozowana podczas rozszerzonego obrazu klinicznego, gdy jest za późno na zapobieganie pierwotnej wadzie. W związku z tym wielu badaczy opowiada się za potrzebą badania populacji pod kątem obecności GC. Ta choroba spełnia wiele wymagań dotyczących chorób poddawanych badaniom przesiewowym, tj. występuje dość często, ma utajoną fazę poprzedzającą objawy kliniczne, jest łatwo diagnozowana metodami biochemicznymi i genetycznymi i można jej zapobiec za pomocą skutecznego i niedrogiego leczenia.

Jednak na razie masowe badania przesiewowe są uważane za przedwczesne z powodu niejasności związanych głównie z przenikaniem GC. Zdecydowanie zaleca się zbadanie krewnych pacjentów z GC, którzy powinni zmierzyć poziom nasycenia transferyny żelazem, zawartość ferrytyny i biochemiczne markery zaburzeń czynności wątroby, a także określić obecność mutacji w genie HFE w pozycji 282 i 63.

Z technicznego punktu widzenia wykrycie tych mutacji nie jest trudne. Powszechnie stosuje się analizę restrykcyjną lub różne formy amplifikacji lub hybrydyzacji specyficznej dla allelu.

4.5.3.2. Dziedziczna trombofilia

Trombofilia jest tendencją do rozwoju zakrzepicy związanej z wrodzonymi i nabytymi zaburzeniami krzepnięcia krwi i fibrynolizą. Trombofilia najczęściej występuje jako zakrzepica żylna i choroba zakrzepowo-zatorowa, które występują z częstością około 1 na 1000 ludności rocznie.

Istnieją rodzinne formy trombofilii, opisane już w latach 50. XX wieku. Pierwszymi zidentyfikowanymi przyczynami wrodzonej trombofilii (NTF) były niedobory antytrombiny III,

białko C i jego kofaktor białka S. Później zidentyfikowano jeszcze dwie formy NTF - mutację koagulacji czynnika V, która powoduje oporność czynnika V na aktywowane białko C, oraz mutację w genie protrombiny G20210A, która zwiększa poziom protrombiny w osoczu. Ponadto umiarkowana hiperhomocysteinemia, często związana z rozpowszechnionym polimorfizmem w genie MTHFR, jest również czynnikiem ryzyka zakrzepicy żylnej.

SKRÓCONA CHOROBA Ciężkość objawów klinicznych NTF jest bardzo zróżnicowana. Często przebiegają w bardzo łagodnej formie, a ich obecność można określić jedynie metodami laboratoryjnymi. Jednak w wielu przypadkach u nosicieli mutacji rozwija się zakrzepica żył głębokich kończyn dolnych, zakrzepica zatorowa płuc, zakrzepowe zapalenie żył powierzchownych, a także zakrzepica żylna innej lokalizacji. Te wrodzone wady zwykle nie wiążą się z ryzykiem zamknięcia tętnicy. NTF predysponują do rozwoju zakrzepicy w młodym wieku: do 40% pacjentów w wieku poniżej 45 lat z niesprowokowaną zakrzepicą żył głębokich ma jedną z postaci NTF. U starszych pacjentów lub w obecności czynników prowokujących NTF obserwowanych w 30% przypadków zakrzepicy. U pacjentów z kombinacją wad dziedzicznych zwiększa się ryzyko powikłań zakrzepowo-zatorowych.

Dziedziczny niedobór antytrombiny III i białek C i S występuje w sumie mniej niż 1% populacji, ale u pacjentów z żylną chorobą zakrzepowo-zatorową (VTE) występuje w prawie 10% przypadków. Ryzyko VTE u takich pacjentów jest 5-8 razy wyższe niż w populacji ogólnej. Przyczyną niedoboru tych naturalnych antykoagulantów może być zmniejszenie ich syntezy lub (częściej) zmniejszenie czynnościowej aktywności białka przy zachowaniu normalnego poziomu. Wady syntezy lub funkcjonowania białek są spowodowane setkami różnych mutacji w tych genach.

Dziedziczna odporność na aktywowane białko C jest najczęstszą przyczyną NTF. W ponad 95% przypadków oporność jest spowodowana mutacją zmiany sensu w genie czynnika V, zwaną Leyden, w której w pozycji 506 argininę zastępuje glutamina. Ta reszta aminokwasowa normalnie powoduje proteolityczne rozszczepienie czynnika V przez aktywowane białko C. Białko C jest naturalnym antykoagulantem, który jest aktywowany przez trombinę-trombomodulinę

kompleks na komórkach śródbłonka i niszczy czynniki Va i viiia, prowadzące do zatrzymania tworzenia się skrzepliny. Proces ten jest znacznie przyspieszany w obecności białka S, które działa jako kofaktor białka C. Jeśli występuje substytucja aminokwasowa w czynniku Va Arg506-Aktywowane Gln białko C nie może go rozbić, co prowadzi do zachowania aktywności czynnika Va i zwiększonego tworzenia skrzepliny (ryc. 4.17).

Mutacja Leiden występuje prawie wyłącznie wśród rasy kaukaskiej, w której nosicielami jest około 5% populacji. Ze względu na dużą częstość tej formy genetycznej w populacji ogólnej należy jednak odnieść się do polimorfizmu

Rys. 4.17. Oporność na aktywowane białko C, spowodowane mutacją Leiden.

w literaturze nazwa mutacji została do niej przymocowana. Wśród pacjentów z ŻChZZ częstość tej mutacji jest wyższa i wynosi około 20%. Ryzyko VTE u nosicieli mutacji Leiden zależy od dawki genu: u heterozygot zwiększa się 2-7 razy, a u homozygot 40-80 razy. Całkowite prawdopodobieństwo wystąpienia choroby zakrzepowo-zatorowej podczas życia nosicieli tej mutacji wynosi 30%.

Allel polimorficzny G20210A w nieulegającym translacji regionie 3 'genu protrombiny w populacji ogólnej występuje z częstością 2%, ale wśród pacjentów z VTE odsetek nosicieli polimorfizmu wzrasta do 7%. Zatem obecność polimorfizmu G20210A w genie protrombiny zwiększa ryzyko VTE o około 3 razy. Patologicznym efektem tego polimorfizmu jest zwiększenie aktywności protrombiny w osoczu. Poziom protrombiny u homozygot AA jest 1,5 raza wyższy niż u homozygot w normalnym allelu GG, co przyczynia się do zakrzepicy. Najwyraźniej mutacja G → A odnosi się do typu mutacji z nabyciem funkcji, ponieważ zwiększa wydajność przetwarzania 3'-końca mRNA, co prowadzi do akumulacji mRNA i zwiększenia syntezy białka protrombiny.

Innym czynnikiem predysponującym do zakrzepicy jest zwiększony poziom homocysteiny, aminokwasu powstającego podczas metabolizmu metioniny. Umiarkowany wzrost homocysteiny zwiększa ryzyko zakrzepicy tętniczej i żylnej. Przyczyną wzrostu może być nieprawidłowa dieta (brak pirydoksyny, kobalaminy, kwasu foliowego) lub czynniki genetyczne, takie jak polimorfizm Al.677

Wał w genie reduktazy metylenotetrahydrofolianowej - enzym odgrywający ważną rolę w określaniu poziomu homocysteiny w osoczu. Aktywność tego wariantu enzymu wynosi tylko około 1/3 normalnego. Około 10% rasy białej to heterozygotyczni nosiciele tego polimorfizmu. Częstość VTE u izolowanych nosicieli tego polimorfizmu nie różni się od normalnej, ale szereg danych pokazuje, że polimorfizm C677T przyczynia się do manifestacji innych NTF.

BEREMENALNOŚĆ I PATOLOGIA PRZESZKODY W czasie ciąży wzrasta poziom zależnych od witaminy K czynników krzepnięcia, zmniejsza się zawartość białka S i hamuje fibrynoliza. Zmiany te są fizjologicznie wykonalne, ponieważ mają na celu zmniejszenie utraty krwi podczas porodu, ale zwiększają również prawdopodobieństwo ŻChZZ w czasie ciąży (2,5 razy), a zwłaszcza w okresie poporodowym (20 razy).

W obecności NTF prawdopodobieństwo to jest jeszcze wyższe i może osiągnąć 100-krotnie u homozygot mutacji Leiden czynnika V. Większość (do 60%) kobiet z VTE, które rozwinęły się w czasie ciąży, ma mutację Leiden.

Oprócz żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej, NTF przyczyniają się do rozwoju patologii położniczej. Naruszenie pełnego krążenia łożyskowego macicy z powodu zakrzepicy może prowadzić do różnych powikłań ciąży, takich jak poronienie, martwe urodzenie, przedwczesne odstawienie łożyska, stan przedrzucawkowy i opóźnienie wzrostu wewnątrzmacicznego. Liczne badania wykazały zwiększoną częstość występowania NTF u pacjentów z tymi powikłaniami. Istnieją również dowody, że obecność mutacji nie tylko u matki, ale także u płodu może dodatkowo zwiększać ryzyko zakrzepicy i zawału łożyska, prowadząc do utraty płodu. Względne ryzyko powikłań ciąży u heterozygotycznych nosicieli mutacji Leiden lub polimorfizmu genu protrombiny G20210A według różnych badań wzrosło średnio 2-3 razy.

Akceptacja doustnych środków antykoncepcyjnych również przyczynia się do rozwoju ŻChZZ. Efekt ten jest zwiększony u kobiet z NTF. Ryzyko rozwoju ŻChZZ u nosicieli mutacji Leiden przyjmujących doustne środki antykoncepcyjne, według różnych szacunków, wzrasta o 20-65 razy. W obecności protrombiny G20210A ryzyko ŻChZZ jest nieco niższe, ale także znacznie przekracza wartość normalną. Na podstawie tych obserwacji zaleca się, aby nie stosować doustnych środków antykoncepcyjnych u kobiet z niedoborem naturalnych antykoagulantów, homozygot do mutacji Leyden oraz w obecności połączonych defektów.

Hormonalna terapia zastępcza po menopauzie jest kolejnym stanem jatrogennym z 2-4-krotnym wzrostem ryzyka VTE. W obecności mutacji Leiden, względne ryzyko może wzrosnąć o 15 razy, a częstotliwość powtarzanej zakrzepicy również wzrasta. W związku z tym, nosiciele NTF, którzy mieli epizody ŻChZZ, nie powinni stosować hormonalnej terapii zastępczej.

WSKAZANIA DO ANALIZY GENETYCZNEJ Analiza mutacji Leiden i polimorfizmu protrombiny G20210A, jak również określenie niedoboru antytrombiny i białek C i S, jest skuteczną metodą identyfikacji osób ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia stanów zakrzepowych. Wykrycie tych mutacji umożliwia nosicielom prowadzenie profilaktycznej terapii przeciwzakrzepowej.

Ze względu na niską bezwzględną częstotliwość ŻChZZ masowe badania przesiewowe populacji pod kątem obecności NTF nie są uzasadnione. Uważa się za bardziej odpowiednie zbadanie następujących grup pacjentów na obecność NTF:

• osoby z ŻChZZ, niezależnie od wieku i nasilenia objawów;

• kobiety z jedną lub więcej samoistnymi poronieniami w późnym stadium lub z dwoma lub więcej poronieniami;

• kobiety w ciąży z wewnątrzmacicznym opóźnieniem wzrostu lub uszkodzeniem łożyska;

• krewni pierwszego stopnia pokrewieństwa pacjenta z NTF w historii;

• kobiety z historią NTF w rodzinie przed zastosowaniem doustnych środków antykoncepcyjnych, hormonalnej terapii zastępczej lub ciąży.

TESTY DIAGNOSTYCZNE Testy o wysokim priorytecie na obecność NTF obejmują:

• oznaczanie aktywności antytrombiny (metoda amidolityczna);

• oznaczanie aktywności białka C (metoda koagulometryczna lub amidolityczna);

• oznaczanie stężenia białka S (całkowite i wolne frakcje antygenu);

• koagulometryczne oznaczanie oporności na aktywowane białko C;

• określenie mutacji Leiden czynnika V;

• oznaczanie polimorfizmu protrombiny G20210A;

• oznaczanie poziomów homocysteiny w osoczu.

Jak widać z powyższej listy, niedobór antytrombiny i białek C i S określa się metodami funkcjonalnymi. Wynika to z faktu, że te wady są spowodowane dużą liczbą mutacji i ich identyfikacja wymaga dużego wysiłku i kosztów, podczas gdy analizy funkcjonalne są proste i niezawodne.

Analiza mutacji Leiden i polimorfizmu protrombiny jest prosta i dobrze uzupełnia testy funkcjonalne. Najwyraźniej analiza polimorfizmu C677T w genie rofolatreduktazy metylenotetragidowej nie ma osobnej wartości diagnostycznej i powinna być stosowana w połączeniu z biochemicznym oznaczaniem stężenia homocysteiny w osoczu. Zastosowanie tego zestawu testów pozwala wykryć wrodzoną wadę czynników krzepnięcia lub wzrost homocysteiny u około 40% pacjentów z ŻChZZ.

Najbardziej niezawodną metodą identyfikacji mutacji Leiden i protrombiny G20210A jest analiza restrykcyjna, ale szeroko stosowana jest także PCR specyficzna dla alleli i hybrydyzacja.

4.5.3.3. Rodzinna hipercholesterolemia

Rodzinna hipercholesterolemia (FHC) jest najwyraźniej najczęstszą chorobą autosomalną dominującą u ludzi. Częstość występowania FHD w większości populacji wynosi 1 na 500. W populacjach z efektem założycielskim formy heterozygotyczne są znacznie częstsze: 1 na 70 u Afrykanerów w Afryce Południowej i 1 na 200 u Kanadyjczyków pochodzenia francuskiego. Z tego samego powodu zwiększa się częstotliwość FHD w Finach, Druzach i Libanie.

Nie wszystkie przypadki FHC są diagnozowane klinicznie. Na przykład w Rosji mniej niż 1% pacjentów z FHCS postawił diagnozę kliniczną, a najskuteczniejsza diagnoza (ponad 40% zidentyfikowanych nosicieli) jest przeprowadzana na Islandii ze względu na małą liczebność populacji z wyraźnym efektem założycielskim i małą zmiennością zmienności.

Głównymi cechami diagnostycznymi SGHS są podwyższony poziom cholesterolu we krwi, obecność ksantomantów ścięgien u pacjenta lub krewnych pierwszego stopnia oraz dominujący wzór dziedziczenia podwyższonego poziomu cholesterolu lub choroby niedokrwiennej serca.

Klinicznie, SGHS objawia się zwiększonym ryzykiem miażdżycy i jej powikłań. Mechanizmy łączące wzrost cholesterolu z rozwojem choroby wieńcowej nie są w pełni poznane. Zakłada się, że wysoki poziom LDL bogatego w cholesterol przyczynia się do ich przenikania do ściany naczynia, gdzie utleniają się i wyzwalają łańcuch reakcji komórkowych prowadzących do akumulacji lipidów i lokalnej reorganizacji ściany naczynia, w wyniku czego powstaje blaszka miażdżycowa. W przypadku FHC ryzyko zgonu z powodu zawału mięśnia sercowego w młodym wieku - do 40 lat - wzrasta 100-krotnie. U nieleczonych mężczyzn z FHD w wieku 60 lat prawdopodobieństwo CHD wynosi około 75%. Według niektórych szacunków, tylko połowa mężczyzn z SGHS ma 60 lat. Średni wiek wystąpienia IHD wynosi 40-45 lat dla mężczyzn, a dla kobiet jest 10 lat starszy. Zatem choroba wieńcowa u pacjentów z FHD rozwija się 10–20 lat wcześniej niż średnia populacji.

Statyny i inne leki obniżające stężenie lipidów są skutecznie stosowane do obniżania poziomu lipoprotein w osoczu w SHHS.

Najcięższych pacjentów (z reguły są to przypadki homozygotyczne) leczy się przez usunięcie nadmiaru LDL przez wymianę osocza. Czasami stosuje się przeszczep wątroby.

MECHANIZMY BIOCHEMICZNE I GENETYCZNE

Gdy poziom cholesterolu SGHS zwiększa się z powodu wzrostu stężenia LDL w osoczu. To zaburzenie metaboliczne jest związane ze zmniejszeniem klirensu LDL przez wątrobę w wyniku zmniejszenia ekspresji lub aktywności receptorów komórkowych pośredniczących w wychwycie cząstek LDL (receptorów LDL). Aktywność receptora LDL w FHCS zmniejsza się na wszystkich komórkach wyrażających ten receptor, jednak konsekwencje funkcjonalne są związane głównie z defektem receptora w wątrobie, ponieważ naruszenie konwersji cholesterolu do kwasów żółciowych prowadzi do zmniejszenia jego wydalania przez jelita. Podobne nieprawidłowości biochemiczne obserwuje się przy zmianie mutacji w białku apoB-100, które jest ligandem dla receptora LDL. W wyniku tej mutacji cząsteczki LDL nie są już rozpoznawane przez receptor LDL i gromadzą się w osoczu.

Gen receptora LDL zawiera 18 egzonów, które kodują sześć funkcjonalnych domen tego białka: peptyd sygnałowy, domena wiążąca ligand, domena homologiczna do poprzednika naskórkowego czynnika wzrostu, miejsce O-glikozylacji, domeny transbłonowe i cytoplazmatyczne. Wszystkie znane mutacje w genie LDLR są gromadzone w bazie danych UMD-LDLR, dostępnej przez Internet. Liczba wpisów w nim przekroczyła 800 i nadal rośnie. Według bazy danych UMD-LDLR substytucje pojedynczych nukleotydów stanowią 90% wszystkich mutacji w genie LDLR, większość z nich to mutacje typu missense i nonsens. Pozostałe 10% to głównie makrotransformacje spowodowane nierówną rekombinacją z ponad 30 kopiami sekwencji Alu obecnych w tym genie. W promotorze znaleziono mniej niż 10 mutacji.

Chociaż SGHS jest chorobą monogenową, ekspresja fenotypowa, a mianowicie ciężkość IHD, różni się znacznie, nawet wśród pacjentów niosących te same mutacje. Niektórzy pacjenci żyją do 80 lat lub więcej, podczas gdy inni umierają na atak serca w wieku 20 lat. Czynniki wpływające na objawy kliniczne mogą być zewnętrzne, metaboliczne i genetyczne.

Spośród czynników środowiskowych szczególną rolę odgrywają palenie i nawyki żywieniowe. Palenie jest jednym z najsilniejszych predyktorów śmiertelności z powodu choroby wieńcowej u pacjentów z FHD. Rola diety w rozwoju

FHCS wykazano porównując pacjentów pochodzenia chińskiego mieszkających w Kanadzie z nosicielami tych samych mutacji, ale mieszkających w Chinach.

Kanadyjscy Chińczycy mają poziom cholesterolu LDL o 70% wyższy niż w Chinach. Ponadto 6 z 16 heterozygot żyjących w Kanadzie miało ksantomy, a 4 miały CHD. Żaden z 18 badanych mieszkających w Chinach nie miał ksantomii ani choroby niedokrwiennej serca. Najwyraźniej takie różnice w objawach klinicznych są związane z różnym spożyciem tłuszczów nienasyconych. Ten przykład wyraźnie ilustruje modyfikujący wpływ czynników zewnętrznych, takich jak dieta, na fenotyp heterozygotycznych SHKS.

Przebieg choroby silnie zależy od rodzaju mutacji powodującej hiperlipidemię. Najpoważniejsza hipercholesterolemia rozwija się w obecności mutacji zerowych, prowadząc do całkowitego braku aktywnego receptora, podczas gdy mutacje z zachowaniem częściowej syntezy lub aktywności receptora LDL zazwyczaj powodują łagodniejszą chorobę.

Istnieje szereg parametrów biochemicznych, które modyfikują rozwój choroby wieńcowej u pacjentów z SHHS. Te czynniki metaboliczne to: cholesterol HDL, białko C-reaktywne i fibrynogen. Niektóre z tych czynników, takie jak cholesterol HDL i lipoproteina Lp (a), mają wyraźną podstawę genetyczną. Inne sprawdzone lub podejrzewane czynniki genetyczne obejmują mutacje w genie lipazy lipoproteinowej - izoformy apolipoproteiny E, pierwotne warianty białka estrowego cholesterolu, polimorfizm paraoksonazy (polimorfizm enzymu nadtlenku lipidów), konkretny genotyp reduktazy metylenotetrahydrofolianowej (związany ze zwiększonym poziomem homocysteiny). oraz mikrosomalne białko przenoszące triglicerydy, wpływające na wydzielanie VLDL.

Zatem, genetycznie, mutacje receptora LDL są głównym czynnikiem determinującym rozwój FHC. Udział innych genów jest niezaprzeczalny, jednak ze względu na stosunkowo niewielką liczbę pacjentów z rozpoznanymi mutacjami receptora LDL wymagane są dalsze badania genów modyfikujących. Idealnie, określenie genotypu pacjenta przez te dodatkowe geny umożliwi określenie stopnia ryzyka choroby wieńcowej i innych powikłań u nosicieli określonej mutacji receptora LDL lub genu apoB-100.

Indywidualny poziom cholesterolu podlega naturalnym zmianom, więc nie można wyciągnąć żadnych wniosków

o dostępności SGHS. Ponadto poziom cholesterolu zależy od wieku, płci i różni się w różnych populacjach. Poziom cholesterolu w FHCS często przewyższa średni poziom w ogólnej populacji, dlatego nie jest możliwe rozpoznanie w oparciu o wyniki pomiaru cholesterolu w niektórych przypadkach.

Obecnie wykrywanie mutacji w receptorze LDL lub genie apoB-100 jest powszechnym kryterium w diagnozie FHC. Mutacja 3500. nukleotydu w genie apoB-100 (defekt rodzinny apoB) jest najczęstszą przyczyną FHC w większości populacji. W Europie i krajach, w których mieszkają ludzie z Europy (Australia, USA, Kanada i Nowa Zelandia), mutacja ta jest spowodowana u 3-5% pacjentów z FHCS. W krajach o złożonej strukturze genetycznej choroby mutacje można znaleźć u 30–50% pacjentów z rozpoznaniem klinicznym SGHS. Wynika to zarówno z nieodpowiedniej wrażliwości metod przesiewowych, jak i nieprawidłowej diagnozy ustalonej na podstawie poziomu cholesterolu i objawów klinicznych. Istnieje również możliwość istnienia dodatkowych genów, oprócz LDLR i APOB, mutacji, którym towarzyszy podobny obraz kliniczny.

W wielu populacjach diagnostyka DNA SGHS jest znacznie uproszczona dzięki obecności ograniczonej liczby zmutowanych alleli.

Jednak w większości populacji genetycznie otwartych, do których należy Rosja, nie stwierdzono pojedynczej mutacji w genie receptora LDL częściej niż u 1% pacjentów z FHC i zwykle znacznie rzadziej. W związku z tym, metody przesiewowe do poszukiwania mutacji, takie jak określenie polimorfizmu jednoniciowej konformacji DNA, a następnie potwierdzenie przez sekwencjonowanie, odgrywają główną rolę w diagnostyce DNA FHCS.

4.5.3.4. Mukowiscydoza

Mukowiscydoza (CF) jest jedną z najczęstszych i jednocześnie poważnych chorób autosomalnych recesywnych u ludzi. Wśród Europejczyków częstotliwość nośna jest zbliżona

1 do 50, a formy kliniczne występują w zależności od regionu z częstotliwością od 1 do 2-3 tysięcy osób.

CF otrzymało swoją nazwę od natury mikroskopowych zmian obserwowanych w trzustce u takich pacjentów. Choroba dotyczy także płuc, wątroby, jelita cienkiego i męskiego układu rozrodczego. Kluczową rolę w patogenezie odgrywa nadmierne wydzielanie śluzu przez nabłonek tych narządów, co prowadzi do niedrożności oskrzeli lub przewodów wydalniczych wątroby i trzustki. Pomimo znacznej poprawy w leczeniu objawowym pacjenci z CF zwykle nie żyją dłużej niż 20-30 lat. Główną przyczyną śmierci jest uszkodzenie płuc spowodowane zablokowaniem oskrzeli, co stwarza korzystne warunki dla wtórnych zakażeń. Przewlekłe infekcje i reakcja zapalna prowadzą do zwłóknienia tkanki płucnej, co w połączeniu z niedrożnością dróg oddechowych może powodować niewydolność oddechową. U 65% pacjentów zablokowanie przewodów trzustkowych zapobiega wydzielaniu enzymów trawiennych do jelita, co prowadzi do zaburzeń trawienia. Podobnie, naruszenie wydzielania żółci przez wątrobę, obserwowane u 5% pacjentów. Oprócz tych objawów u 10% noworodków rozwija się niedrożność jelita cienkiego, wymagająca interwencji chirurgicznej. Ponadto 95% mężczyzn z CF ma bezpłodność. Charakterystyczną cechą mukowiscydozy, która jest szeroko stosowana w jej diagnozie, jest zwiększone zasolenie potu związane z upośledzoną resorpcją C1

nabłonek wyściełający przewody gruczołów potowych.

KF jest powodowany przez mutacje w białku kodowanym przez gen CFTR (przezbłonowy regulator przewodnictwa w mukowiscydozie). Ten gen składa się z 27 egzonów i koduje białko o masie cząsteczkowej 168 kDa, która zawiera dwie domeny transbłonowe, dwie wewnątrzkomórkowe domeny wiążące nukleotydy i domenę regulacyjną. To białko jest kanałem dla jonów C1 -. Kanał ten jest aktywowany przez zależną od cAMP kinazę białkową, która fosforyluje domenę regulacyjną. Wyjście C1 - z komórki rozpoczyna łańcuch reakcji, które prowadzą do zamknięcia kanałów Na + i zwiększają produkcję wydzieliny śluzowej.

Najczęstszą przyczyną CF jest delecja trzech nukleotydów w kodonie 508, prowadząca do utraty fenyloalaniny. Częstość tej mutacji u pacjentów z CF waha się od 50% w Europie Środkowej do prawie 90% na północy. W wyniku tej mutacji normalne przetwarzanie białka zostaje przerwane i po syntezie nie jest transportowane do błony plazmatycznej, ale jest zatrzymywane w retikulum endoplazmatycznym i ulega degradacji. Istnieje jednak duża liczba

inne mutacje uszkadzające to białko; ich liczba zbliża się do 1000. Te rzadsze mutacje mogą mieć różny wpływ na kanał chlorkowy, na przykład, częściowo lub całkowicie zmniejszyć syntezę białek, zakłócić jej transport wewnątrzkomórkowy lub zmniejszyć funkcjonalną aktywność kanału. Niektóre z tych mutacji powodują tylko częściowe zmniejszenie syntezy lub aktywności kanału, co może prowadzić do różnych manifestacji funkcjonalnych. W tych przypadkach, gdy zachowuje się mniej niż 3% aktywności, rozwija się ciężka CF, której towarzyszy zmiana trzustki. Jeśli zaoszczędzisz 3-8% aktywności, wpływa to na płuca, a trzustka jest normalna. Jeśli aktywność kanału C1 wynosi 8-12%, obserwuje się łagodne postacie, takie jak azoospermia u mężczyzn. Jednak taka prosta zależność nie zawsze jest obserwowana. Przewiduj przebieg choroby jest możliwy tylko wtedy, gdy istnieje homozygotyczność dla delecji fenyloalaniny-508 lub jednoczesna obecność tej delecji i mutacji G551D. W obecności tych mutacji choroba postępuje w klasycznej ciężkiej postaci ze zmianą trzustki. W większości innych przypadków związek między rodzajem mutacji a manifestacją choroby jest trudny do przewidzenia. Istnieje coraz więcej dowodów na to, że CF jest chorobą oligogenną, a jej objawy fenotypowe zależą nie tylko od natury mutacji, ale także od zestawu genów modyfikujących obecnych u pacjenta.

CF można prawie zawsze zdiagnozować na etapie prenatalnym za pomocą analizy DNA z kosmków kosmówki, albo bezpośrednio określając mutacje, albo stosując analizę powiązań przy użyciu polimorficznych markerów wewnątrzgenowych w przypadkach, gdy mutacje u chorego dziecka są nieznane. Obecnie rozważana jest kwestia badania populacji pod kątem obecności CF. Zgromadzone informacje na temat struktury genetycznej CF pozwoliły nam wybrać 30 mutacji z prawie 1000 znanych mutacji, które jednak wyjaśniają 90% przypadków mukowiscydozy w różnych regionach Europy i USA. Technicznie, diagnostyka DNA CF jest dość dobrze rozwinięta, a wiele komercyjnych zestawów jest produkowanych do jej wdrożenia.

4.5.3.5. Kardiomiopatia przerostowa

Kardiomiopatia przerostowa (HCM) jest jedną z najczęstszych chorób u ludzi z wyraźną predyspozycją genetyczną. Występuje z częstością 1 na 500, która jest znacznie wyższa niż częstotliwość innej rodzinnej postaci kardiomiopatii - rozszerzonej (1 na 2500). HCM jest dziedziczone

na typ autosomalny dominujący i charakteryzuje się penetracją do 75%. Klinicznie choroba objawia się w postaci przerostu lewej i / lub prawej komory i wzrostu wielkości przedsionków. Przerost jest zwykle asymetryczny i wpływa na przegrodę międzykomorową. Histologicznie, przerost i nieregularny układ kardiomiocytów, jak również zwłóknienie śródmiąższowe, obserwuje się w mięśniu serca. Choroba prowadzi do arytmii i nagłej śmierci, a także do niewydolności serca.

Przyczyną choroby na poziomie molekularnym jest dysfunkcja białek, które tworzą sarkomery, więc hcmp jest czasami nazywany chorobą sarkomerów. Przerost jest kompensacyjną odpowiedzią mięśnia sercowego na zmniejszenie kurczliwości. Obecnie zidentyfikowano 11 genów, w których mutacje prowadzą do hcmp (tabela 4.11).

Mutacje białek sarkomerów mają różny wpływ na funkcję skurczową kardiomiocytów. W wyniku mutacji zmiany sensu często powstają stabilne, ale nieaktywne białka, które są wprowadzane do sarkomeru i zakłócają jego funkcję, tj. mieć dominujący negatywny wpływ. Natomiast mutacje

Tabela 4.11. Mutacje prowadzące do kardiomiopatii przerostowej

z przesunięciem ramy powodują powstawanie nieaktywnych skróconych białek, które podlegają przyspieszonej degradacji. W obu przypadkach zmniejsza się aktywność skurczowa i rozwija się kompensacyjna reakcja przerostowa.

Rodzaj mutacji może wpływać na ciężkość choroby. Na przykład wysokie ryzyko nagłej śmierci sercowej jest związane z mutacjami w genie Arg MYH74 uncje-Gln, Arg45Z-Cis i arg72Z-Gly Natomiast mutacja Gly25b-Glu, Val606-Met i Lei908- Wał nie jest związany ze zwiększonym ryzykiem arytmii. Mutacje w genie MYBPC3 są zwykle związane z łagodnym przerostem u młodych pacjentów, późnym początkiem choroby i stosunkowo korzystnym rokowaniem. Zatem wiedza o rodzaju mutacji nie tylko potwierdza diagnozę hcmp, ale w niektórych przypadkach pomaga w określeniu rokowania.

Ze względu na znaczną różnorodność genetyczną, diagnostyka molekularna hcmp wykazuje pewną złożoność. Ze względu na różnorodność mutacji, metody przeszukiwania, takie jak analiza polimorfizmu jednoniciowej konformacji DNA, elektroforeza w gradiencie denaturującym, a także HPLC denaturująca są używane głównie do poszukiwania tej choroby. Poszukiwanie mutacji odbywa się głównie w genie łańcucha ciężkiego β-miozyny, jak również w genach troponiny T serca i białka wiążącego miozynę sercowo C.